梨黑斑病菌對五味子提取物的敏感性研究

張 眉 高小寬 紀君陽 孫文文

（衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

黑斑病是影響我國梨產(chǎn)量及品質(zhì)的主要病害之一，鏈格孢菌是導(dǎo)致梨感染黑斑病的主要源頭[1]。梨樹早期落葉和嫩梢枯死都可能是梨黑斑病菌導(dǎo)致的，而且梨黑斑病的發(fā)生會讓果實提前掉落并且伴隨著裂果現(xiàn)象，嚴重削弱樹勢，降低樹體的生命力和抗病能力[2]。該病的潛伏侵染期在梨樹的花期和幼果期，涉及時間較長，在果實的貯藏期間梨黑斑病仍存在并且不易控制和防范[3]。

近年防治梨黑斑病的研究很多，但是利用中藥提取物對梨生長時期進行防治的做法很少，我國中草藥資源較豐富，中草藥中具有許多抗菌、抑菌、殺蟲作用的成分，這些成分是自然存在的，一般易于降解，對環(huán)境積蓄毒性的可能性不大[4，5]。本試驗通過中藥提取物對梨葉片黑斑病病菌抑制效果進行研究，采用離體葉盤法測定五味子提取物對梨黑斑病菌的抑制效果，從而篩選出五味子提取物對梨葉片黑斑病抑制的最佳濃度及梨葉片最佳浸液時間，以此為五味子提取物防治梨葉片黑斑病提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為新型生物防治劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料制備

1.1.1 病原菌制備。采集患有梨黑斑病的病葉，用70%酒精進行表面擦拭消毒，無菌水沖洗后切取病健交界處組織，在無菌操作條件下移置到PDA平板上，于25℃保溫培養(yǎng)，表面長出分生孢子后進行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上作為供試菌株在冰箱中保存待用。

1.1.2 五味子中藥粗提取。分別對五味子葉進行粉碎，用80%乙醇進行提取，在搖床中以150 rpm，25℃振蕩2 d，用離心機以3 500 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后用80%乙醇定容，最后將定容好的提取物容器進行編號放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的制備。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1 000 ml，煮沸30 min。將紗布對折用于濾去馬鈴薯殘渣，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20 g，邊加邊攪拌防止糊化，將瓊脂加熱熔化后加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的無菌水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1 000 ml。分裝至250 ml三角瓶中，每瓶100 ml，包裝完成后，在0.103 Mpa、121℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 病原菌的擴大化培養(yǎng)。取實驗室冰箱保存菌種，在超凈工作臺下進行菌種的擴大培養(yǎng)。首先用經(jīng)滅菌的打孔器于菌板約2/3直徑處鉆取菌餅，將鉆取的菌餅用接種針轉(zhuǎn)移到PDA平板中心處，菌面朝下。置于光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)期間要定時觀察，將有雜菌感染的平板進行處理，等待梨黑斑病菌菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 離體抑菌試驗。首先配制所需濃度溶液，配制的五味子葉片提取物質(zhì)量濃度分別為50mg/L、100mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、1 500 mg/L、2000 mg/L、4 000 mg/L，將配制好的五味子葉提取物溶液放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎秒x體葉盤法測定梨黑斑病菌對五味子葉提取物的敏感性。從衡水學(xué)院校園采集葉齡相同的梨健康葉片，用自來水沖洗晾干，葉片正面朝上浸泡于上述不同處理藥液及對照組中，每種處理液及對照按照0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h的不同時間浸泡，然后將葉盤上的藥液用吸水紙吸干，葉背面朝上置于底部墊有用相同藥液潤濕的托盤內(nèi)，每個葉盤上接種2個菌餅，每個處理3次重復(fù)，最后把托盤用保鮮膜罩好，保持濕潤狀態(tài)。設(shè)置對照。培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果。菌落生長直徑采用十字交叉法測量，根據(jù)測量數(shù)據(jù)進行抑制率的計算。

1.2.4 離體抑菌實驗數(shù)據(jù)處理。菌絲生長抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。用SPSS15.0統(tǒng)計軟件求出藥劑毒力回歸方程和EC50值。

1.3 發(fā)病情況調(diào)查。接種7 d后，根據(jù)葉盤發(fā)病面積，采用9級法記錄病情。0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉片面積的5%以下；3級，病斑面積占整個葉片面積的5.1%～25.0%；5級，病斑面積占整個葉片面積的25.1%～50.0%；7級，病斑面積占整個葉片面積的50.1%～75.0%；9級，病斑面積占整個葉片面積的75.1%以上。根據(jù)下式計算各處理的病情指數(shù)。病情指數(shù)=Σ(各級發(fā)病葉盤數(shù)×相對極值)/(調(diào)查總?cè)~盤數(shù)×9)；防治效果=[1-(處理葉盤病情指數(shù)/對照葉盤病情指數(shù))]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度及時間對梨黑斑病菌菌絲生長的影響。不同濃度及時間對梨黑斑病菌的影響如表1所示，梨葉片浸液0.5 h時，在濃度為50 mg/L時抑制率極低，幾乎沒有抑制效果，但是隨著濃度的升高抑制率隨之升高，在各個濃度梯度之間，抑制率差異不顯著。葉片浸液3 h、4 h時，在濃度為2 000 mg/L時抑制效果均最好，抑制率分別為49.04%、48.05%。葉片在不同濃度下的抑制率是隨著浸泡時間延長而增加，當浸泡時間增至3 h時，無論哪個濃度藥劑，抑制率均達到最高值。因而可得出，梨葉片在五味子提取液下最佳浸液時間及最佳濃度分別為3h、2000mg/L。

表1 不同濃度及時間對梨黑斑病菌的抑制率影響

2.2 藥液對梨黑斑病菌的室內(nèi)毒力測定。不同濃度藥液及浸泡時間對梨葉黑斑病影響的相關(guān)毒力回歸方程及EC50值、相關(guān)系數(shù)如表2所示。由數(shù)據(jù)可得，每個毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.916 683 443，說明離體葉盤保濕法具有較高的精密度。葉片浸液3 h的抑制作用最好，毒力最強，EC50為3 482.454 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.982 320 364。

表2 不同濃度藥液浸泡時間對梨黑斑病菌的毒力測定結(jié)果

2.3 病情記錄。通過9級法記錄病情，病斑級數(shù)及患病葉盤數(shù)情況見表3，由數(shù)據(jù)得出，梨葉的病情指數(shù)均分布在1級和3級，病斑級數(shù)越大就證明梨葉受梨黑斑病菌的侵染越嚴重，在梨葉浸泡時間為4 h之前，隨著浸液時間的延長，梨葉病斑級別為1級的葉盤數(shù)也在增長，這就代表著浸液時間的延長抑制了梨葉片上病斑的擴大，并且此現(xiàn)象跟抑菌效果有一定的聯(lián)系，在葉片浸液時間為4 h時，其1級葉盤數(shù)量有所下降，3級葉盤數(shù)量增加。由此可得，在葉片浸泡時間為3 h時，抑菌效果最佳。

表3 使用9級法記錄病情

2.4 病情指數(shù)及防治效果。由9級法得出的各級病斑，計算出各個時間段的處理葉盤病情指數(shù)及防治效果，如表4所示，葉片浸泡在對照組時，病情指數(shù)為33.33%，在葉片浸泡3 h時病情指數(shù)為最小值18.51%，較對照的病情指數(shù)下降了14.82%，并且防治效果最好，達到了44.4%，由此可看出，梨葉片浸液時間為3h時對梨葉期的梨黑斑病防治效果達到最佳。

表4 不同浸液時間的病情指數(shù)及防治效果

3 結(jié)論

在梨黑斑病菌對五味子提取物的敏感性測定試驗中，得出梨葉片在五味子提取物中的最佳浸液時間及藥劑最佳濃度分別為3 h、2 000 mg/L。