硫酸銅對燕麥根尖細胞毒害研究

蘇佳欣 高汝勇 馬彥榮 孫如月 董 瑜 呂亞慈

（衡水學院生命科學系 河北 衡水 053000）

銅是植物生長發(fā)育必需的微量元素，是細胞色素氧化酶、多酚氧化酶以及抗壞血酸氧化酶等多種酶類的組成成分之一，同時銅元素也是各種氧化酶活性的核心元素[1]；但過量的銅會影響植物的生長，土壤中含過量銅會對植物新根生長造成抑制，使根尖硬化，吸收能力減弱，植株生長也會受到影響[2]。

燕麥俗稱油麥、玉麥，是一種低糖、高蛋白質(zhì)、高脂肪、高能量食品，其營養(yǎng)成分含量高，質(zhì)量優(yōu)。我國對燕麥的需求量較大，目前對燕麥的研究尚屬起步階段，大部分是針對其生物學特性與栽培、加工工藝等進行的研究，針對重金屬對燕麥的毒害研究還未見報道。因此，開展重金屬脅迫對燕麥遺傳毒性的研究很有必要。本試驗探究不同濃度的銅對燕麥植物根尖細胞造成的影響，從細胞的水平分析硫酸銅對燕麥根尖細胞染色體畸變、微核率、有絲分裂的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料。燕麥材料：白燕2號(由張家口市農(nóng)科院提供)；硫酸銅(天津市大茂化學試劑廠)，用蒸餾水分別配制0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L等不同濃度的硫酸銅溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)。將白燕2號種子洗干凈，用0.1%氯化汞消毒10～15 min，浸泡2～24 h，放入白瓷盤中，置于烘箱中25℃培養(yǎng)生根。

1.2.2 試驗處理。待種子初生根長到1～2 cm時，挑選飽滿、生命力旺盛的種子，分別放入濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L的硫酸銅中，并分別處理6 h、12 h、24 h、48 h，以蒸餾水作對照。選擇燕麥種子生命力較旺盛的幼根，將根尖剪下來放入卡諾氏固定液中(V無水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)固定2～24 h，用70%的乙醇保存。試驗時用1 mol/L的鹽酸水解5～10 min。改良品紅室溫下染色15 min，常規(guī)壓片、鏡檢，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)，每個處理觀察10～15個根尖(隨機選擇)，至少5 000～6 000個細胞，典型圖像用顯微攝像系統(tǒng)進行拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理及評價方法

1.3.1 指標計算。細胞分裂指數(shù)=(分裂細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù))×100%；微核率=(出現(xiàn)微核的細胞數(shù)/間期細胞總數(shù))×100‰；染色體畸變率=(畸變細胞數(shù)/分裂期細胞總數(shù))×100%。

1.3.2 統(tǒng)計分析。用SPSS(spss for windows)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 硫酸銅處理對燕麥根尖分生區(qū)細胞有絲分裂指數(shù)的影響。如表1所示，本試驗中設置5個不同濃度的硫酸銅，并且每個濃度又分不同時間處理燕麥根尖，結果顯示，各處理燕麥根尖的分裂指數(shù)均高于對照。燕麥根尖有絲分裂指數(shù)隨著硫酸銅濃度的升高和時間的延長受到抑制，且與對照相比有差異(表1)。隨著硫酸銅濃度的增大，燕麥根尖細胞的有絲分裂指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。同一濃度隨著處理時間延長，除800 mg/L外，有絲分裂指數(shù)呈上升趨勢。

表1 硫酸銅處理對燕麥根尖分生區(qū)細胞有絲分裂指數(shù)的影響 (%)

2.2 硫酸銅處理對燕麥根尖微核千分率的影響。由表2可知，不同濃度的硫酸銅對燕麥根尖細胞微核有顯著的影響。試驗組與對照組相比，微核畸變率有顯著的差異，當硫酸銅濃度是400 mg/L時，染色體微核率隨時間的延長呈現(xiàn)極度上升的趨勢。同一處理時間，細胞的微核千分率隨著硫酸銅濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢。在硫酸銅濃度達到400 mg/L時，微核率千分率最大。濃度在400 mg/L以內(nèi)時，微核千分率隨時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。當濃度達到800 mg/L，48 h時，微核千分率隨時間的延長呈下降的趨勢。

表2 硫酸銅處理對燕麥根尖細胞微核千分率的影響(‰)

2.3 硫酸銅處理對燕麥根尖分生區(qū)細胞畸變率的影響。不同濃度的硫酸銅均可導致多種類型的染色體畸變，常見的染色體畸變類型有染色體橋、染色體粘連、染色體滯后、染色體不同步、染色體蓬松、染色體不均等分裂。由表3可以看出，相同時間內(nèi)染色體畸變率隨硫酸銅濃度的升高而呈現(xiàn)逐步升高的趨勢；在同一濃度時，隨時間的延長染色體畸變率升高。當硫酸銅濃度達到800 mg/L時，染色體畸變率急劇升高，且遠遠高于其他濃度的畸變率。

表3 硫酸銅處理對燕麥根尖細胞染色體畸變率的影響(%)

3 結論與討論

植物從土壤中吸收的銅主要聚集在根部。銅污染對植物根系有直接的毒害作用，導致植物根系新陳代謝過程紊亂[3]。對于植物來說，有絲分裂最旺盛的是根尖部位，也是植物對土壤中營養(yǎng)元素及重金屬污染受害最敏感區(qū)域。研究表明，植物銅中毒的主要癥狀為抑制種子的萌發(fā)，根系變短，外形畸變等[4]。本試驗的研究結果也表明了高濃度硫酸銅對植物生長有抑制作用。倪才英[5]在研究土壤銅污染對紫云英的毒害時發(fā)現(xiàn)，當外界銅超過植物所承受的濃度時，紫云英根尖扭曲腐爛，導致細胞質(zhì)壁分離，原生質(zhì)被破壞，本試驗結果和倪才英的研究結果是一致的。

本試驗結果表明，重金屬銅脅迫對燕麥根尖細胞的分裂指數(shù)、微核數(shù)、分裂期細胞的染色體畸變率存在著顯著影響。燕麥根尖隨著硫酸銅處理濃度的升高和時間的延長，微核率、染色體畸變率呈上升趨勢。當濃度達到200～400 mg/L時，銅元素對燕麥根尖細胞分裂是有促進作用的，當濃度達到800 mg/L時，燕麥根尖表現(xiàn)出有絲分裂指數(shù)、微核率降低。過量的銅對燕麥根尖的有絲分裂毒害超過了植物的自身保護作用，使細胞中酶的活性降低，導致DNA合成速率減慢，分裂間期延長。高濃度的硫酸銅有誘發(fā)染色體畸變的作用，因為較高濃度的硫酸銅不僅對細胞的畸變有影響，而且能阻止細胞紡錘絲的微管蛋白聚合。

通過對不同濃度銅離子對燕麥根尖染色體的毒害作用進行研究，了解了重金屬銅脅迫對植物遺傳毒性的影響。但是針對銅離子對分裂間期蛋白質(zhì)的合成，與復制、轉錄、染色體運動有關的蛋白質(zhì)和酶的關系，還有待于進一步探究。