伽馬射線輻照對(duì)血小板貯存損傷的影響*

劉奇 王世春 姚春艷

血液輻照是采用射線對(duì)全血及成分血進(jìn)行照射，利用電離輻射直接損傷具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞或其他目標(biāo)細(xì)胞中的DNA，進(jìn)而減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生[1]。研究發(fā)現(xiàn)利用血液輻照技術(shù)可以有效的對(duì)塞卡病毒、朊病毒、埃博拉病毒、新型冠狀病毒進(jìn)行滅活，是有效阻斷病毒傳播的方式[2]。伽馬射線輻照是最常見(jiàn)的血液輻照方法，對(duì)血小板來(lái)說(shuō)，輻照劑量通常為25～30 Gy，可以有效減少血小板病原體污染，預(yù)防血小板輸血相關(guān)的移植物抗宿主病，伽馬射線輻照是滅活血小板中殘留的其他免疫細(xì)胞及病毒污染簡(jiǎn)便快捷的方法[3]。

早期研究表明伽馬射線輻照不會(huì)對(duì)血小板功能造成明顯的損傷[4]，但是近年來(lái)隨著檢測(cè)手段的進(jìn)步及檢測(cè)指標(biāo)的日益完善[5]，發(fā)現(xiàn)伽馬射線輻照對(duì)血小板貯存損傷有一定的影響（見(jiàn)圖1），血小板貯存損傷（PSL）是指血小板在體外保存過(guò)程中，血小板的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的一系列改變，這些變化的總和被概括為血小板貯存損傷[6]。血小板貯存損傷主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：首先是在保存過(guò)程中由于新陳代謝產(chǎn)生的乳酸及活性氧（ROS）積累在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致pH值下降、糖酵解增加、線粒體功能紊亂；其次血小板細(xì)胞膜的去極化導(dǎo)致血小板凋亡增加、膜上許多關(guān)鍵性的功能蛋白提前活化、膜表面顆粒大量釋放脫落；最后一個(gè)方面是血小板形態(tài)由圓盤(pán)狀變?yōu)榍驙?，致使其粘附及聚集功能下降[7]。這些改變對(duì)血小板輸注后在患者體內(nèi)的存活率和止血功能有巨大影響。本文就伽馬輻照對(duì)血小板的蛋白組學(xué)、氧化應(yīng)激、病原體滅活及輸注療效作一簡(jiǎn)短回顧。

圖1 伽馬射線輻照引起血小板貯存損傷的機(jī)制圖

1 伽馬射線輻照對(duì)血小板蛋白組學(xué)的影響 血小板蛋白質(zhì)對(duì)血小板發(fā)揮止血功能有重要的作用，目前已鑒定出4 000余種血小板蛋白質(zhì)，它們屬于各種亞蛋白組，對(duì)血小板生成及功能有重要影響[8]，明確伽馬輻照對(duì)血小板蛋白組學(xué)的改變具有重要意義。THIELE等[9]采用SDS-PAGE分離、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜LC-ESI-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)，比較伽馬射線輻照的血小板（輻照劑量30 Gy）、紫外線照射的血小板（照射劑量（3.9±0.1）J/cm2）以及正常保存的血小板的相關(guān)蛋白質(zhì)譜變化，總共鑒定了948種蛋白質(zhì)，其中721種是多肽類(lèi)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示在保存第1天，與正常保存對(duì)照組相比：伽馬輻照引起49種蛋白質(zhì)發(fā)生變化，紫外照射引起23種蛋白質(zhì)發(fā)生改變。各組保存5天后，與對(duì)照組第一天相比：紫外照射處理引起58種、伽馬射線輻照處理引起50種、對(duì)照組本身36種蛋白發(fā)生變化。進(jìn)一步基因分析顯示許多蛋白質(zhì)的催化活性以及蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)合能力受到影響。研究結(jié)果表明伽馬射線輻照在第1天引起的蛋白組學(xué)變化強(qiáng)于紫外線照射，但在第5天紫外照射處理會(huì)導(dǎo)致血小板蛋白損傷增加，總的來(lái)說(shuō)伽馬射線輻照相對(duì)紫外照射來(lái)說(shuō)對(duì)血小板蛋白貯存損傷的影響相對(duì)較小。

伽馬射線輻照對(duì)血小板的蛋白質(zhì)組學(xué)的負(fù)面影響已有報(bào)道[10]。伽馬射線輻照血小板后顯示血小板細(xì)胞骨架蛋白水平的改變，如肌動(dòng)蛋白隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。伽瑪射線輻照后第1天顯示蛋白酶體激活劑復(fù)合體亞基1亞型2（PACS1I2）的水平較高，該復(fù)合體參與DNA損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)血小板的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架重排。伽馬射線輻照可以影響二硫鍵異構(gòu)酶（ERP72）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SLC44A2）、肌球蛋白α1鏈（TPM1）、Septin-11、Parvalbumin α等蛋白的活性，進(jìn)而影響血小板聚集、細(xì)胞骨架重排和血小板氧化效應(yīng)等細(xì)胞功能。Rho蛋白是一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量為20～25 KD的三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）結(jié)合蛋白，又被稱(chēng)為Rho GTP酶，Rho蛋白及其調(diào)控分子在血小板細(xì)胞骨架重排方面發(fā)揮了至關(guān)重要的調(diào)控作用，參與了血小板收縮、血小板偽足形成以及血小板顆粒分泌等重要過(guò)程[11]。伽馬射線輻照后可以降低血小板Rho二磷酸鳥(niǎo)苷（GDP）解離抑制因子1的相對(duì)濃度，它們通過(guò)抑制GDP的解離和隨后的GTP與Rho蛋白的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)大多數(shù)Rho蛋白的GDP/GTP交換反應(yīng)。

伽馬輻照可以提高Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-1b亞型1（Rasrelated protein Rap-1b isoform 1）的表達(dá)，該蛋白位于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的下游和血小板整合素αⅡbβ3的上游，對(duì)血小板的止血功能至關(guān)重要[12]。類(lèi)似地，伽馬輻照可以提高鈣調(diào)蛋白的表達(dá)，表明伽馬輻照后可以影響血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)能力[13]。還發(fā)現(xiàn)其他蛋白質(zhì)在伽馬輻照后的血小板中表達(dá)上調(diào)，例如腫瘤蛋白翻譯控制1（TPT1），它可能在血小板的激活中起作用，因?yàn)樗且环N鈣結(jié)合蛋白，參與維持細(xì)胞微管的穩(wěn)定[14]。

2 伽馬射線輻照對(duì)血小板氧化應(yīng)激的影響 活性氧能夠調(diào)控血小板活化、聚集、誘導(dǎo)血小板凋亡，是生物體內(nèi)氧化反應(yīng)過(guò)程中形成的氧自由基，低濃度的活性氧是細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等所必需的胞內(nèi)信號(hào)分子，過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激并引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA發(fā)生氧化損傷[15]。活性氧可以通過(guò)不同的途徑激活血小板，被認(rèn)為是血小板貯存損傷的標(biāo)志之一[16]，血小板產(chǎn)生活性氧有兩個(gè)重要的來(lái)源，包括通過(guò)激活NAPDH（腺嘌呤二核苷酸磷酸）等氧化酶產(chǎn)生的胞漿活性氧和線粒體呼吸作用等生成的活性氧。

研究發(fā)現(xiàn)伽馬射線輻照使血小板中殘留的T淋巴細(xì)胞失活的同時(shí)也會(huì)通過(guò)不同的機(jī)制電離輻射產(chǎn)生活性氧，對(duì)血小板的貯存損傷有一定的影響[17]。血小板在正常保存過(guò)程中，活性氧和乳酸鹽脫氫酶呈時(shí)間依賴(lài)型緩慢增高，而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和葡萄糖呈時(shí)間依賴(lài)型逐漸減少。然而NODEH[18]等研究發(fā)現(xiàn)伽馬射線輻照當(dāng)天會(huì)加速線粒體產(chǎn)生活性氧，致使血小板內(nèi)活性氧（H2O2、超氧陰離子）的水平明顯提高，之后活性氧逐漸回調(diào)至正常水平，但保存后期活性氧又顯著提高。血小板胞內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平及上清液中還原型谷胱甘肽的含量在伽馬射線輻照當(dāng)天顯著降低，而乳酸脫氫酶在胞內(nèi)的表達(dá)下調(diào)而上清液中的活性卻在伽馬射線輻照后提高，說(shuō)明伽馬射線輻照加速了血小板的新陳代謝，增強(qiáng)了氧化應(yīng)激。分析原因作者認(rèn)為早期活性氧濃度的增加是伽馬輻照的直接效應(yīng)，而后續(xù)回調(diào)至正常水平可能是以消耗血小板內(nèi)與活性氧清除相關(guān)的酶（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）為代價(jià)獲取的。后期積累的活性氧造成細(xì)胞損傷誘導(dǎo)乳酸脫氫酶的釋放，加劇氧化應(yīng)激的改變，進(jìn)一步造成血小板貯存損傷。

抗氧化酶蛋白（DJ-1）在血小板氧化應(yīng)激反應(yīng)中起主要作用，DJ-1在伽馬射線輻照后過(guò)表達(dá)。伽馬射線輻照后誘導(dǎo)血小板氧化應(yīng)激標(biāo)志物硫醇異構(gòu)酶（ER-60蛋白酶：催化和協(xié)調(diào)基于氧化還原蛋白質(zhì)的二硫鍵修飾，從而調(diào)節(jié)血小板功能）的表達(dá)顯著下調(diào)[19]。通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法分析上清液中與氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物，結(jié)果證實(shí)經(jīng)伽馬輻照處理的血小板上清培養(yǎng)液中的代謝率和氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加，此項(xiàng)研究表明伽馬射線輻照可能會(huì)加速由于氧化應(yīng)激引起的血小板衰老[20]。

血小板中線粒體通過(guò)電子鏈傳遞（ETC）過(guò)程中的氧化磷酸化合成三磷酸腺苷（ATP），在這個(gè)過(guò)程中，由于ETC泄漏的電子對(duì)氧分子（O2）進(jìn)行單電子還原而產(chǎn)生超氧陰離子（O2–）[21]。研究表明[22]，在細(xì)胞暴露于電離輻射后，線粒體產(chǎn)生的活性氧會(huì)導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞暴露于5 Gy伽馬射線輻照后，發(fā)現(xiàn)輻照后細(xì)胞發(fā)生明顯的下列氧化應(yīng)激時(shí)間序列變化：在輻照后幾分鐘內(nèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平快速增加，但在30分鐘后活性氧水平逐漸恢復(fù)正常，輻照后12小時(shí)檢測(cè)到線粒體功能障礙，線粒體電子傳遞鏈中調(diào)節(jié)活性氧釋放的最重要的NADH脫氫酶的活性降低，輻照24小時(shí)以后，線粒體產(chǎn)生ROS的能力明顯升高，線粒體DNA氧化明顯增強(qiáng)。輻照后線粒體功能障礙導(dǎo)致的持續(xù)氧化應(yīng)激，可能會(huì)加速促進(jìn)輻照誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定。通過(guò)給予抗氧化劑使線粒體功能正?；赡苁菧p緩輻照引起的血小板氧化應(yīng)激、延長(zhǎng)血小板保存時(shí)間的一種潛在策略。

3 伽馬射線輻照對(duì)血小板殘留免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子滅活的影響 發(fā)熱性非溶血性反應(yīng)（NHFTRs）是輸血相關(guān)的常見(jiàn)不良反應(yīng)[23]，大量研究表明，血小板保存過(guò)程中會(huì)分泌細(xì)胞因子，如白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，血小板中細(xì)胞因子水平的升高與發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)有關(guān)。血小板中細(xì)胞因子的來(lái)源被認(rèn)為是受污染的白細(xì)胞，特別是單核細(xì)胞所產(chǎn)生，因此減少或使血小板中殘留的污染細(xì)胞失活是防止細(xì)胞因子產(chǎn)生一種重要舉措。

研究表明[24]伽馬射線輻照可以使血小板中受污染的淋巴細(xì)胞、部分白細(xì)胞失活，從而減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血小板第四因子（PF4）等細(xì)胞因子及趨化因子在血小板保存過(guò)程中的產(chǎn)生和積累。在血小板保存過(guò)程期間產(chǎn)生的細(xì)胞因子中，IL-8是一種重要炎癥介質(zhì)，當(dāng)機(jī)體受到感染及某些自身免疫性疾病的影響時(shí)，由具有Toll樣受體的細(xì)胞分泌，并在炎癥局部、血清和體液中顯著增加。但對(duì)于伽馬射線輻照血小板后對(duì)IL-8的合成與分泌存在一定爭(zhēng)議，POURFATHOLLAH等[25]研究表明經(jīng)輻照和未輻照的血小板在保存過(guò)程中IL-8濃度均有不同程度的升高，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而VOLL[26]研究卻表明在保存5天后，伽馬射線輻照血小板后會(huì)抑制p選擇素（CD62p）的表達(dá)以及IL-1b和IL-8的分泌。

此外研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)伽馬射線照射的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNCs）產(chǎn)生的細(xì)胞因子數(shù)量與未經(jīng)處理的白細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子數(shù)量沒(méi)有顯著差異[24]。對(duì)術(shù)中回收的自體血進(jìn)行伽馬射線輻照，并對(duì)輻照前后血中的促炎介質(zhì)、腫瘤壞死因子、白介素21β、嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述物質(zhì)并沒(méi)有因?yàn)檩椪斩?。而且?jīng)輻照的自體血回輸后，患者體內(nèi)上述物質(zhì)的含量很少，較輸注前未明顯上調(diào)，從而不會(huì)導(dǎo)致免疫炎性反應(yīng)[27]。

總的來(lái)說(shuō)筆者認(rèn)為伽馬射線輻照在血小板保存過(guò)程中通過(guò)抑制細(xì)胞因子合成與分泌的途徑從而來(lái)減緩免疫反應(yīng)的效果有限，盡管伽馬射線輻照可以使T淋巴細(xì)胞等失活使其不能夠再增殖，可以減少由少量白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但不能消除和阻止細(xì)胞因子的合成和分泌，甚至有可能產(chǎn)生與未經(jīng)處理的細(xì)胞同等的細(xì)胞因子數(shù)量。此外FAST和HEDDLE等[24，28]研究發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)刺激、未經(jīng)處理或伽馬輻照的細(xì)胞上清液中檢測(cè)到IL-6的水平有可能足以潛在的引發(fā)輸血不良反應(yīng)。

為了有效防止保存過(guò)程中血小板中細(xì)胞因子的產(chǎn)生和積累，應(yīng)該使用其他的方法，比如保存前過(guò)濾去掉相關(guān)免疫細(xì)胞，如白細(xì)胞去除術(shù)。此外以核黃素加入血漿或血小板制品在紫外線作用下對(duì)核酸進(jìn)行靶向修飾從而滅活病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原微生物的去除技術(shù)[29]，可以導(dǎo)致病原微生物核酸的不可逆性損傷，阻止其增殖，也可通過(guò)該機(jī)制滅活包括淋巴細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞，從而有效抑制免疫細(xì)胞因子的合成和分泌，但此種方法可能會(huì)增加血小板的貯存損傷。

4 伽馬射線輻照對(duì)血小板輸注療效的影響 ZHU等[30，31]研究評(píng)估和比較了伽馬輻照機(jī)采血小板和非輻照機(jī)采血小板在化療引起的血小板減少癥患者中的止血功能、輸血效果和安全性。結(jié)果顯示伽馬輻照后對(duì)保存期間的血小板計(jì)數(shù)、平均體積（MPV）、平均分布寬度（PDW）、pH值、血小板低滲休克反應(yīng)、血小板形態(tài)及相關(guān)的凝血參數(shù)均無(wú)顯著影響，在輸血后1小時(shí)和24小時(shí)的病人的止血相關(guān)的功能參數(shù)（最大振幅：MA，反應(yīng)時(shí)間：R、Angle角）、輸血后24小時(shí)的CCI（血小板輸注后增高指數(shù)）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組均無(wú)關(guān)于出血、不良事件和急性輸血反應(yīng)的事件發(fā)生。總的來(lái)說(shuō)伽馬射線輻照血小板后對(duì)血小板的止血功能，輸血效率均無(wú)明顯影響，但為保證最好的治療效果，建議不論是普通血小板制品還是輻照血小板制品，均應(yīng)盡早輸注到患者體內(nèi)。伽瑪射線輻照血小板在常規(guī)使用中是安全的，即使是對(duì)于免疫功能?chē)?yán)重受損或接受過(guò)干細(xì)胞移植的高?；颊咭彩侨绱?，輸注伽馬輻照機(jī)采血小板能夠在一定程度上降低患者的體液免疫反應(yīng)。

但是上述研究同時(shí)表明，輸注保存0～3天的伽馬射線輻照的血小板，輸血后1小時(shí)CCI及24小時(shí)的平均CCI比輸注非輻照的血小板組都低（輻照vs非輻照，1 h：11.59±5.97 vs 12.83±6.33；24 h：5.76±4.05 vs 6.56±4.10），即使這一差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但提示伽馬輻照血小板可能會(huì)增加血小板的貯存損傷，導(dǎo)致血小板的輸注療效和CCI降低。此外也有研究表明[32，33]，未輻照的血小板產(chǎn)生更高的CCI，隨著輻照后保存時(shí)間的延長(zhǎng)，伽馬射線輻照對(duì)CCI的負(fù)面影響可能會(huì)更加明顯。JULMY等[33]在單變量分析中，預(yù)先輻照的血小板的輸血效率為27.7%，而輸注當(dāng)天輻照的血小板的輸血效率為35.0%，研究表明當(dāng)天輻照的單采血小板輸注效果明顯優(yōu)于預(yù)先輻照的血小板的輸注效果，兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前各種指南規(guī)定，血小板濃縮物的輻照可以在保存過(guò)程中的任何階段進(jìn)行[3，34]，但實(shí)際上目前有相關(guān)研究結(jié)果[33]更支持血小板應(yīng)該在輸血前接受血液輻照并至少在輻照后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行輸注為最佳，以減少輻照引起的貯存損傷對(duì)血小板輸注療效的影響。

5 總結(jié)展望 伽馬輻照可以消除血小板中殘留的白細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)能力及抑制同種異基因T淋巴細(xì)胞分化的能力[35]，因而可以預(yù)防HLA抗原同種免疫反應(yīng)及TA-GVHD。血液制品的最佳輻照劑量[1]應(yīng)以既能滅活淋巴細(xì)胞又能維持其他血液成分的功能與活力以及最小的損傷為選擇，何其通等[36]探討不同劑量輻照后淋巴細(xì)胞的滅活和對(duì)血小板功能的影響，發(fā)現(xiàn)劑量達(dá)到35 Gy時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的滅活效果顯著且對(duì)血小板的臨床止血效果沒(méi)有明顯影響，但過(guò)高劑量的伽馬射線輻照或者輻照后保存時(shí)間過(guò)久[18]，均會(huì)對(duì)血小板的貯存損傷造成影響，目前已經(jīng)明確的機(jī)制有：伽馬射線輻照可以通過(guò)誘導(dǎo)H2O和O2等方式產(chǎn)生活性氧，破壞血小板內(nèi)氧化還原平衡，造成氧化應(yīng)激致使線粒體功能受損，血小板蛋白組學(xué)發(fā)生改變，基因發(fā)生氧化損傷。

輻照對(duì)血小板的產(chǎn)品質(zhì)量有一定的影響，因此對(duì)于不同類(lèi)型的病人是否需要接受輻照血小板輸注這一關(guān)鍵問(wèn)題，2020年8月英國(guó)血液病學(xué)學(xué)會(huì)（BSH）發(fā)布了輻照成分血的應(yīng)用指南[37]，對(duì)于有先天性T細(xì)胞免疫缺陷或確診之前的新生兒和嬰兒，必須接受輻照血小板并且持續(xù)時(shí)間至少到出生后6個(gè)月；對(duì)于輸注來(lái)自1級(jí)和2級(jí)親屬的血小板均宜輻照；宮內(nèi)輸血和換血時(shí)，宜選擇采集后5 d以?xún)?nèi)的血液做輻照，并在輻照后24 h內(nèi)輸注；對(duì)于霍奇金氏淋巴瘤成人和兒童患者宜終生輸注輻照血小板。但指南不推薦對(duì)所有血液均進(jìn)行大規(guī)模的輻照，對(duì)于造血干細(xì)胞移植患者、嚴(yán)重細(xì)胞免疫缺陷患者、胎兒和新生兒、免疫能力特別強(qiáng)的個(gè)體等這類(lèi)特殊病人，是否必須輸注輻照血小板及輸注后的治療效果仍需高質(zhì)量的數(shù)據(jù)支撐，對(duì)于某些特殊情況下患者急需輸注血小板可以不用輻照，以免錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)間。

此外潛在的細(xì)菌污染是造成血小板保存期短的一個(gè)重要原因，輸注含有細(xì)菌的血小板的患者可能會(huì)發(fā)生嚴(yán)重感染，伽馬射線輻照滅活細(xì)菌受細(xì)菌類(lèi)型及細(xì)菌濃度的限制，細(xì)菌濃度過(guò)高時(shí)，伽馬輻照不足以使細(xì)菌失活，而對(duì)極低濃度的細(xì)菌污染，伽馬輻照也會(huì)受到細(xì)菌性質(zhì)（革蘭氏陽(yáng)性及陰性）等因素的影響[38]，目前推薦的伽馬輻照血液的劑量對(duì)不同的細(xì)菌種類(lèi)、細(xì)菌濃度的滅活仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突