滁菊總黃酮抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷作用研究

王 琮， 陳 浩， 李飛躍， 俞 浩

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

局灶性腦缺血再灌注損傷(Focal cerebral ischemia-reperfusion injury,FCIRI)是神經(jīng)功能喪失和神經(jīng)元死亡的主要原因。許多臨床研究和動物實驗已經(jīng)證實了FCIRI發(fā)病機理的復(fù)雜性相對較高,涉及多個病理生理過程的相互作用,其中氧化應(yīng)激在整體發(fā)病機理中起到至關(guān)重要的作用,當前常用藥有溶栓藥、抗炎藥、抗凝血藥等,作用機制單一,臨床治療效果受到一定程度的限制。早在幾千年前,醫(yī)方就記載了許多治療FCIRI相關(guān)疾病的珍貴中藥和經(jīng)典方劑,近年來,中藥在治療FCIRI方面顯示了較好臨床的效果表現(xiàn),越來越多的缺血性腦血管疾病的探索性實驗使用中藥開展。菊花栽培已有3 000多年的歷史,由于其不同的生境和品種,在我國的不同地區(qū)都有分布,菊花植物的形狀和化學(xué)成分也各不相同。其中滁菊是安徽滁州產(chǎn)道地藥材,《本草害利》記載了滁州菊作為藥菊應(yīng)用的歷史。藥理實驗研究表明,滁菊的黃酮類成分具有抗心肌缺血、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等多種作用。本項目組研究發(fā)現(xiàn),滁菊總黃酮(Total flavonoids of Chuju,TFCJ)具有抗大鼠急性心肌缺血和心肌缺血再灌注損傷作用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,觀察TFCJ抗大鼠FCIRI作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

使用的TFCJ粉末由項目組于安徽科技學(xué)院藥學(xué)綜合實驗室制備,經(jīng)紫外可見分光光度法(UV-VIS)檢測，總黃酮含量為60.21%,相關(guān)檢測指標所用的SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒、CAT試劑盒購于南京建成生物工程研究所,其他常規(guī)試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠,體重(180±20) g,購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場,動物合格證號:0013260,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2019-0002。將大鼠置于(23±2) ℃,55%±5%濕度,每12 h明暗循環(huán)一次的環(huán)境下。

1.3 分組與給藥

120只大鼠隨機分成6組(n=20):假手術(shù)組:每日灌胃10 mL/kg 0.5%羧甲基纖維素(CMC)溶液,手術(shù)僅分離血管;模型組:每日灌胃10 mL/kg 0.5%CMC溶液,進行大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)手術(shù);TFCJ高劑量組:每日灌胃40 mg/kg TFCJ,用0.5%CMC溶液配制,進行MCAO手術(shù);TFCJ中劑量組:每日灌胃20 mg/kg TFCJ,用0.5%CMC溶液配制,進行MCAO手術(shù)。TFCJ低劑量組:每日灌胃10 mg/kg TFCJ,用0.5%CMC溶液配制,進行MCAO手術(shù)。血塞通組:每日灌胃25 mg/kg血塞通,用0.5%CMC溶液配制,進行MCAO手術(shù)；以上全部大鼠每日灌胃1次,周期為7 d。

1.4 TFCJ的提取與純化

滁菊粉末與60%乙醇按照料液比20∶1混合后,70 ℃超聲提取2次,每次40 min。收集所有提取液,趁熱抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,濃縮至無乙醇味,濃縮液4 200 r/min離心15 min,取上清液,用70%乙醇以1 BV/h的流速通過D-101大孔樹脂柱洗脫,收集洗脫液并置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收乙醇,剩余液體置冷凍干燥機中冷凍干燥,得TFCJ粉末,通過UV-VIS測定其含量為60.21%。

1.5 FCIRI模型制備

FCIRI模型的制備方法為,從頸外動脈(Carotid artery,CA)剪口插線,沿頸總CA插入頸內(nèi)CA直至大腦中CA,插入長度約20 mm,缺血2 h,拔線恢復(fù)血供,再灌注24 h。

1.6 檢測指標

1.6.1 神經(jīng)損傷程度評價 采用雙盲法對模型大鼠神經(jīng)損傷癥狀進行評分,判斷損傷等級。Ⅰ級:無神經(jīng)損傷癥狀;Ⅱ級:不能完全伸展左側(cè)前爪; Ⅲ級:不能完全伸展左側(cè)前爪,行走時向左側(cè)繞圈 ;Ⅳ級:不能完全伸展左側(cè)前爪,行走時向左側(cè)偏癱 ;Ⅴ級：意識喪失,失去知覺,無法自發(fā)行走。

1.6.2 指標測定 腦指數(shù)測定：大鼠再灌注24 h時稱重后,處死取腦。腦組織使用生理鹽水沖洗3次,每次3 mim,去除嗅球、小腦等組織,僅保留完整大腦。清理大腦表面異物,如軟腦膜、表面血管等組織。避免影響稱重結(jié)果,吸去表面多余水分,最終記錄腦重量；腦梗死面積測定：各組大鼠再灌注24 h時立刻處死并收集腦組織,將收集的腦組織稍微凍硬表面并沿冠狀面的切片(厚度約2 mm),平放入避光處理的容器,倒入一定量的2%TTC溶液,放入設(shè)置37 ℃培養(yǎng)箱孵育15 min,拍照并分析梗死面積；血清及腦組織SOD、GSH-PX、CAT及MDA含量測定：大鼠腹主動脈取血,9 000 r/min離心10 min,取血清;取腦組織勻漿9 000 r/min離心10 min,取上清。取血清和腦組織勻漿測定SOD、GSH-Px、CAT和MDA；病理組織學(xué)檢查：各組大鼠再灌注24 h時立刻處死并收集腦組織,將收集的腦組織固定于4%多聚甲醛溶液24 h,脫水、透明、包埋并制成4 μm冠狀面腦片,并用HE染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 對FCIRI大鼠神經(jīng)損傷的影響

模型組大鼠神經(jīng)損傷癥狀均高于假手術(shù)組(

P

<0.01),但并未出現(xiàn)嚴重程度達到Ⅴ級。與模型組比較,TFCJ高、中劑量神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(

P

<0.05)(表1)。

表1 TFCJ對FCIRI大鼠神經(jīng)損傷癥狀的影響

2.2 對FCIRI大鼠腦指數(shù)及腦梗死面積的影響

與假手術(shù)相比,模型組的腦指數(shù)和腦梗死面積均顯著增加(

P

<0.01)。與模型組相比,TFCJ各劑量組的腦指數(shù)和腦梗死面積均顯著降低(

P

<0.01)(表2)。

表2 TFCJ對FCIRI模型大鼠腦指數(shù)及腦梗死面積的影響

2.3 對FCIRI大鼠血清氧化應(yīng)激的影響

由表3可知,與假手術(shù)組相比,模型組血清SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低,MDA含量顯著增加(

P

<0.01)。與模型組比較,TFCJ顯著提高血清SOD、GSH-Px、CAT活性,降低MDA含量(

P

<0.01)。

表3 TFCJ對FCIRI大鼠血清氧化應(yīng)激的影響

2.4 對FCIRI大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

由表4可知,與假手術(shù)組相比,模型組腦組織SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低,MDA含量顯著提高,具有顯著性差異(

P

<0.01)。與模型組比較,TFCJ高、中劑量組腦組織SOD、GSH-Px活性顯著提高(

P

<0.01);TFCJ各劑量組腦組織CAT活性明顯提高,MDA含量明顯降低(

P

<0.05)。

表4 TFCJ對FCIRI大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

2.5 對FCIRI大鼠腦組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織未見明顯損傷,海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞核無固縮,包膜完整,細胞間隙正常(圖1 A),模型組腦組織明顯損傷,結(jié)構(gòu)疏松,細胞排列雜亂,細胞核固縮,半影區(qū)組織腫脹(圖1 B)。與模型組比較,隨著TFCJ劑量增加,腦組織損傷程度明顯減輕,細胞排列相對規(guī)則,海馬區(qū)神經(jīng)細胞水腫和細胞核固縮逐漸減輕。

圖1 TFCJ對FCIRI大鼠腦組的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化的保護作用Fig.1 The protective effects of TFCJ on MCAO inducing morphological and structural changes

3 結(jié)論與討論

我國缺血性腦血管疾病高發(fā),每年約450萬人發(fā)病,并呈逐年上升之勢,每年約有210萬人死于該病。目前已經(jīng)開發(fā)了使用重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)進行早期恢復(fù)血管再通以治療急性缺血性中風(fēng)的方法。MCAO涉及缺血和再灌注兩個過程,再灌注早期自由基的蓄積、級聯(lián)反應(yīng)和神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致腦組織缺血損傷的主要原因,再灌注中后期增加腦出血的風(fēng)險,促進腦水腫的發(fā)展,并對血腦屏障造成更嚴重的損害,尚不清楚由再灌注本身引起的FCIRI額外傷害的潛在機制。本研究采用線栓法復(fù)制模型,其是FCIRI的經(jīng)典且常用的動物模型。它在很多方面都具有優(yōu)勢:易于操作,給動物帶來小的傷口;具有高重復(fù)性,并產(chǎn)生嚴重的血腦屏障破壞和明顯的腦水腫的腦缺血性損傷。因此,MCAO模型適合FCIRI研究。結(jié)果顯示模型組神經(jīng)功能損傷評分提高,往往與神經(jīng)損傷成比例;腦指數(shù)增加,說明腦組織含水量增高;腦梗死面積增大,說明MCAO導(dǎo)致缺血區(qū)域梗死。TFCJ能夠有效降低腦梗死面積,改善神經(jīng)功能評分,減輕腦指數(shù)。結(jié)果表明,TFCJ具有明確的腦組織保護作用。

氧化應(yīng)激是腦損傷加重的重要原因,其與活性氧(ROS)的逐漸增加有關(guān),因為缺血再灌注后迅猛誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,導(dǎo)致腦組織中氧化因子和抗氧化因子間比例失衡。再灌注后ROS產(chǎn)生增加會增加出血性梗塞,腦水腫和梗塞面積。因此,增加抗氧化因子水平是治療FCIRI的有效方法。SOD是一種在體內(nèi)細胞不可或缺的活性蛋白酶,催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為HO和分子氧,進而減輕因體內(nèi)的氧自由基至損傷的作用,保護人體免受過氧化和組織損傷。GSH-Px可以清除HO,由于HO有可能轉(zhuǎn)化為其他自由基,因此其可減輕氧化應(yīng)激程度,腦組織缺血缺氧壞死的程度與GSH-Px組織水平有關(guān),GSH-Px水平升高可抑制FCIRI。CAT是生物體中都發(fā)現(xiàn)的一種常見酶,并且是所有酶中周轉(zhuǎn)率最高的酶之一,其作用是分解氧自由基經(jīng)SOD歧化產(chǎn)生HO,避免遭受細胞毒害。MDA是脂質(zhì)過氧化作用最終有毒產(chǎn)物,也是氧化損傷的重要標志,MDA含量的增加與細胞的壞死和凋亡有關(guān),可反映機體消除自由基的能力。

因此,使用具有抗氧化特性且安全有效的治療藥劑干預(yù)氧化損傷提供了行之有效的治療策略。本研究中測量了SOD、GSH-Px、CAT和MDA,以評估氧化應(yīng)激水平。模型組大鼠血清和腦組織中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著降低,而MDA水平升高,說明MCAO抑制抗氧化因子的活性,氧化因子得不到及時的清理,整體的動態(tài)平衡被打破,氧化因子的蓄積從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激程度逐漸加重,進一步發(fā)展嚴重導(dǎo)致腦組織區(qū)域性缺血缺氧,造成局灶性的組織不可逆的壞死。我們發(fā)現(xiàn)TFCJ可增加MCAO大鼠SOD、GSH-Px和CAT的活性并減少MDA,氧化因子和抗氧化因子的動態(tài)平衡逐漸恢復(fù),一定程度上逆反氧化應(yīng)激的程度。這些結(jié)果表明,TFCJ能夠抑制 MCAO引起的氧化應(yīng)激。

為進一步探究TFCJ對腦組織病理變化的影響,HE染色實驗結(jié)果表明,模型組大鼠海馬神經(jīng)細胞排列紊亂,且細胞核濃縮;經(jīng)TFCJ治療模型大鼠馬神經(jīng)細胞更整齊也更緊密。結(jié)果表明,TFCJ具有改善腦組織病理形態(tài)作用。

杜鵑總黃酮通過激活血管TRPV4誘導(dǎo)內(nèi)皮源性超極化因子介導(dǎo)的反應(yīng)改善腦缺血損傷。香青蘭總黃酮通過下調(diào)AMPK信號通路,抑制與細胞凋亡相關(guān)的炎性介質(zhì)釋放,以保護MCAO模型動物。秋葵花總黃酮升高SOD含量,降低一氧化氮和MDA含量降低,上調(diào)Nrf2、HO-1和NQO1的表達,表明其通過清除自由基和激活Nrf2-ARE途徑來保護FCIRI。本文主要檢測氧化應(yīng)激指標以及腦組織形態(tài)學(xué)病理變化來證明TFCJ具有抗FCIRI作用,下一步準備對抗氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白進行檢測。

本研究對TFCJ治療FCIRI的藥理作用提供了基礎(chǔ)的理論依據(jù),為臨床清熱解毒藥物治療FCIRI的深入研究提供了研究方向,同時為今后滁菊中藥材及產(chǎn)品的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。發(fā)揮腦保護和神經(jīng)保護功能的途徑具有多樣性,TFCJ具體發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的生物學(xué)機制仍存在許多問題需要研究解決。