SbWus和SbBbm基因與活性炭對(duì)高粱轉(zhuǎn)化效率的影響

牛 玲， 李杰勤， 劉言龍， 梁 緣， 盧朋宇， 詹秋文

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

高粱(

Sorghum

bicolor

(L.)

Moench

)是繼小麥(

Triticum

aestivum

L.)、水稻(

Oryza

sativa

L.)、玉米(

Zea

mays

L.)和大麥(

Hordeum

vulgare

L.)之后的全球第五大谷類作物，具有抗逆性較強(qiáng)、低耗水、耐鹽堿、產(chǎn)量高等優(yōu)良特性。高粱既可以用來生產(chǎn)糧食、制酒、制糖，也可以用作優(yōu)質(zhì)青綠飼料和青貯飼料，其用途廣泛。關(guān)于作物愈傷誘導(dǎo)分化成苗研究已有一些報(bào)道，如Ahmadabadi等通過對(duì)玉米Pa91×H99的研究，初步建立了以幼苗葉段為外植體的愈傷誘導(dǎo)及植株再生體系，并用基因槍法實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化。小麥組織培養(yǎng)中幼胚誘愈率高且愈傷組織分化能力強(qiáng)，是一種理想的外植體來源。有研究者先后從水稻各部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株。與其他植物相比，高粱通過愈傷誘導(dǎo)分化成苗獲得再生植株相對(duì)更為困難,如趙利銘等用高粱成熟種子和成熟胚作為外植體，通過愈傷組織再生途徑建立了植株再生體系，但是不同基因型高粱愈傷組織的誘導(dǎo)率存在差異。而有關(guān)于通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高高粱遺傳轉(zhuǎn)化效率未見報(bào)道。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究始于20世紀(jì)70年代，首次在微生物大腸桿菌中獲得成功。在與高粱近緣的玉米研究上，Lowe等利用玉米形態(tài)發(fā)生調(diào)控因子Bbm和Wus2促進(jìn)了單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化。另外，在高粱植物組織培養(yǎng)中，褐化現(xiàn)象非常嚴(yán)重，通常將培養(yǎng)基染成黑褐色，甚至導(dǎo)致培養(yǎng)材料死亡。活性炭是一種較強(qiáng)的吸附劑，它可以吸附培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等有害物質(zhì)，從而有效地減輕褐變。王金萍等利用活性炭促進(jìn)玉米幼胚苗的生長發(fā)育。但是目前關(guān)于活性炭在促進(jìn)高粱組培生根上的作用未見報(bào)道。本研究以高粱成熟種子為外植體材料，旨在通過MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)，將種子誘導(dǎo)的愈傷采用基因槍法轉(zhuǎn)入

SbWus

和

SbBbm

基因,探討其分化誘導(dǎo)效果，篩選出誘導(dǎo)率、轉(zhuǎn)基因效率較好的品種，同時(shí)分析不同濃度活性炭處理對(duì)其生根的影響，為建立有效的高粱品種遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系及遺傳育種奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高粱IS4581、IS4698、IS5292、Tx430種植于安徽科技學(xué)院種植科技園(種子引自國際干旱半干旱作物研究所，屬于常規(guī)種，系前期從120個(gè)高粱品種篩選而來，能夠誘導(dǎo)出愈傷)，白天生長溫度為28 ℃，夜里溫度為21 ℃，正常田間管理，在高粱抽穗授粉前進(jìn)行套袋，成熟之后收獲種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 將試驗(yàn)所用到的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、滲透培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配制好，將配制好的液體培養(yǎng)基攪拌均勻調(diào)節(jié)pH值，使用高壓蒸汽鍋滅菌，滅菌后在無菌的超凈工作臺(tái)上將液體培養(yǎng)基加入相應(yīng)的激素，倒入無菌培養(yǎng)皿做好區(qū)分，待培養(yǎng)基凝固備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件 高粱愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱28 ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)4周以后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7～15 d。分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)所需條件：試驗(yàn)材料生長環(huán)境溫度為：(28±2) ℃，光強(qiáng)：1 000～2 000 lx，光周期為16/8 h光暗交替的植物組織培養(yǎng)室，分化與生根培養(yǎng)需要每2周換一次新板。

1.2.3 外植體的消毒處理 先將成熟種子進(jìn)行挑選，選擇飽滿的種子，將挑選好的飽滿高粱成熟種子分別放入50 mL離心管中，加入適量75%的酒精，在恒溫振蕩器中37 ℃、220 r/min振蕩5 min，在完全封閉的超凈工作臺(tái)上，用滅菌蒸餾水清洗1次，加入少許 0.1% HgCl和3～5滴Tween 20，在恒溫振蕩器中37 ℃、220 r/min振蕩10～15 min，在完全封閉的超凈工作臺(tái)中用滅過菌的蒸餾水在離心管中清洗種子至少5次，上下顛倒搖晃直至不出現(xiàn)泡沫。清洗干凈過離心管倒扣在超凈工作臺(tái)上備用。

1.2.4 高粱成熟種子愈傷的誘導(dǎo)、繼代、分化 將IS4581、IS4698、IS5292、Tx430的成熟種子作為外植體，在無菌的超凈工作臺(tái)上，將清洗好的成熟種子接種在MS培養(yǎng)基中，每板30粒，分別標(biāo)記好品種名稱、接種日期，對(duì)高粱愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)、繼代。篩選出誘導(dǎo)效率最好的品種進(jìn)行分化培養(yǎng)并進(jìn)行生根體系的優(yōu)化。

1.2.5 高粱成熟種子轉(zhuǎn)基因組合設(shè)置 通過基因槍法在繼代后的愈傷組織中轉(zhuǎn)入

SbWus

和

SbBbm

基因，處理如表1所示。

表1 高粱成熟種子轉(zhuǎn)基因基因槍組合

1.2.6 不同濃度活性炭下的生根培養(yǎng) 再生植株生長到3～4 cm時(shí)分別轉(zhuǎn)移到0、1、2 g/L三種不同濃度的活性炭生根培養(yǎng)基上(表2)，每處理測定3根苗，重復(fù)2次，觀察生根情況(包括根數(shù)、出現(xiàn)根的天數(shù))。

表2 不同濃度活性炭生根處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SbWus和SbBbm基因?qū)Ω吡挥鷤T導(dǎo)分化效率的影響

對(duì)4個(gè)品種的愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明：不同高粱成熟種子作為外植體愈傷誘導(dǎo)率不同(表3)。其中，IS4698高粱的愈傷組織形成率最高，誘導(dǎo)率為54.42%。

表3 不同高粱品種成熟種子愈傷組織形成率

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)Ω吡怀墒旆N子的分化誘導(dǎo)結(jié)果表明，IS5292、Tx430雖然可以誘導(dǎo)愈傷，但是不能通過基因槍法分化成苗，IS4581和IS4698高粱品種轉(zhuǎn)基因有效，其中IS4698高粱B處理下對(duì)比A處理，分化率和成苗率在0.01水平下差異顯著，證明

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)S4698成熟種子的分化誘導(dǎo)顯著提高。IS4581高粱種子在轉(zhuǎn)基因的作用下，也可以分化成苗，但是F處理對(duì)比E處理差異不顯著，證明

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)S4581高粱種子作用不顯著。綜上所述，

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)Ω吡籌S4698成熟種子遺傳轉(zhuǎn)化效率極顯著提高(表4～5)。針對(duì)分化培養(yǎng)過程中4個(gè)高粱品種都有不同程度的褐化現(xiàn)象，下一步探討活性炭對(duì)高粱生根體系的影響。

表4 轉(zhuǎn)基因?qū)Ω吡环只实挠绊?/p>

表5 轉(zhuǎn)基因?qū)Ω吡怀擅缏实挠绊?/p>

2.2 不同活性炭濃度對(duì)高粱生根的影響

通過比較3種活性炭濃度對(duì)高粱生根效率的影響，發(fā)現(xiàn)根數(shù)在不同濃度間差異極顯著(表6和圖1)，且以處理3活性炭濃度為2 g/L最高，極顯著高于其他兩種濃度；從出根天數(shù)來看，出根天數(shù)間差異顯著，處理1最長，雖處理3對(duì)比處理2差異不顯著但是均值最小，故出根天數(shù)最短。因此，不同濃度活性炭處理生根試驗(yàn)時(shí)，處理3效果最好，活性炭濃度為2 g/L。

表6 活性炭的生根效率

圖1 IS4698成熟種子轉(zhuǎn)基因分化生根

3 結(jié)論與討論

Wu E等通過優(yōu)化組織培養(yǎng)基，使得高粱組織培養(yǎng)、再生和遺傳轉(zhuǎn)化得到了顯著改善。本研究中，通過

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)Ω吡怀墒旆N子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)IS5292、Tx430雖然可以誘導(dǎo)愈傷，但是不能分化成苗。這說明不同高粱之間在組織培養(yǎng)上有較大差異，這與朱莉等的研究結(jié)論基本一致。選用更容易分化的材料才能適用于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，進(jìn)而去完善高粱的生根體系構(gòu)建。本研究表明

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)Ω吡怀墒旆N子遺傳轉(zhuǎn)化效率具有顯著的促進(jìn)作用，IS4698為轉(zhuǎn)基因愈傷誘導(dǎo)成苗效果顯著。IS4581雖分化率較高，但轉(zhuǎn)基因效率不顯著。因此，如何促進(jìn)

SbWus

和

SbBbm

基因?qū)Ω吡籌S4581轉(zhuǎn)基因效率的提高需要更進(jìn)一步研究試驗(yàn)。IS4698品種轉(zhuǎn)基因的成功為建立高粱成熟種子的遺傳轉(zhuǎn)化奠定良好基礎(chǔ)。

呂宗友等研究表明，活性炭能降低褐化，而且活性炭可提供暗培養(yǎng)環(huán)境，提高生根率。陳雄偉等研究表明，當(dāng)活性炭含量高于2 g/L時(shí)，不定根數(shù)量及長度表現(xiàn)出一定程度的抑制效應(yīng)，這也是本研究設(shè)置最高濃度為2 g/L的原因，結(jié)果表明活性炭濃度為2 g/L時(shí)為最適濃度，根數(shù)最多，根粗壯茂盛，有利于提高組培苗的生根率，有效地減輕褐化，那么當(dāng)活性炭濃度更高時(shí)是否可以更加減輕褐化則尚待進(jìn)一步的試驗(yàn)。