不同消毒方法在洋蔥組織培養(yǎng)中的應(yīng)用及優(yōu)化

董利萍 郭振鋒 杜瑞卿

摘 要：分析不同消毒方法對洋蔥種子處理影響的重要性，以便科學(xué)地篩選出主要因素及最優(yōu)方案。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、響應(yīng)面法分析，結(jié)果表明，浸泡方法與時(shí)間對污染率、發(fā)芽率都有顯著影響;三種不同殺菌劑處理對洋蔥種子發(fā)芽率有顯著影響; 70%酒精對污染率、發(fā)芽率無顯著影響， 10%次氯酸鈉有顯著影響，兩者與污染率Y1、發(fā)芽率Y2呈顯著的二次回歸函數(shù)關(guān)系;不同消毒液處理對污染率有顯著影響。綜合得出：在不含洗滌劑的溫水中浸泡12 h，此時(shí)污染率低，發(fā)芽率高;不添加任何殺菌劑處理最好; 70%酒精處理（x1）2 min，與10%次氯酸鈉處理（x2）10 min組合時(shí)，洋蔥種子發(fā)芽率44.12%最高，污染率52.89%最低; 0.1%HgCl2和Tween20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min結(jié)果最為理想。

關(guān)鍵詞：洋蔥;種子;消毒方法;統(tǒng)計(jì)分析;優(yōu)化

中圖分類號：S633.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）07-076-05

Application and optimization of different disinfection methods on onion tissue culture

DONG Liping1， GUO Zhenfeng1， DU Ruiqing2

（1. Department of Landscape Architecture， Henan Forestry Vocational College， Luoyang 471002， Henan， China;2. School of Life Science and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan， China）

Abstract： In order to study the importance of different disinfection methods on onion seed and find out the main factors and optimal solution， Chi square test and response surface method were used to analyze the experimental results. The results showed that the pollution rate and germination rate were significantly affected by soaking method and time. The seed contamination rate of onion was not affected by three fungicides， while the germination rate was significantly affected. Influencing factors A （70% alcohol） was found no significant effect on pollution rate and germination rate， while factors B （10% sodium hypochlorite）was revealed significant effect on pollution rate and germination rate. Different disinfectant treatments had significant effect on the pollution rate. It was concluded that the most reliable and ideal immersion method and time was soaking 12 h in warm water exclusive of detergent， and the pollution rate was low， the germination rate was high. The best fungicide treatment was control group， which was not added any fungicide. The optimum disinfection time combination was 70% alcohol（x1）for 2 min， 10% sodium hypochlorite（x2）for 10 min， and the germination and contamination rate of onion seeds were 44.12% and 52.89% 0.1% HgCl2 and Tween20 in the proportion of 10 000∶1 mixed solution disinfection for 10 min is the optimal combination.

Key words： Onion; Seeds; Disinfectant methods; Statistical analysis; Optimization

洋蔥是百合科蔥屬中以肉質(zhì)鱗片和鱗芽構(gòu)成產(chǎn)品器官的二年生草本植物，營養(yǎng)豐富，而且具有殺菌、降脂、降壓、抗哮喘等多種保健功能，深受人們喜愛。洋蔥是兩年生異花授粉作物，目前中國大多依然是常規(guī)育種，但耗時(shí)耗力，效率低，通常要12年以上，并且受種質(zhì)資源的限制較大，很難取得進(jìn)展[1-2]。近來年也有不少人用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行快繁，但是用種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，首先碰到的就是污染嚴(yán)重的問題[3-4]。關(guān)于洋蔥種子采取不同消毒處理對污染率及發(fā)芽率的影響，有關(guān)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行了報(bào)道，但存在以下不足：（1）浸泡方法與時(shí)間、三種不同殺菌劑處理、不同消毒時(shí)間處理、不同消毒液處理，每種處理方式的各組間，都是直觀的數(shù)據(jù)比較，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異性，缺少科學(xué)性。（2）不同消毒時(shí)間處理，屬于全面試驗(yàn)，但未能按照二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)（響應(yīng)面法）進(jìn)行方差分析、建立回歸方程，得出優(yōu)選方案。（3）對各種不同的處理，2個(gè)不同的觀察指標(biāo)（污染率和發(fā)芽率目標(biāo)要求相反）缺少有效的綜合分析?；诖?，筆者對不同消毒方法在洋蔥組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，重新進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了綜合性的統(tǒng)計(jì)分析，以期為同類型研究提供新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是洋蔥品種中生赤玉，來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，于2019年4—5月在南陽師范學(xué)院生物樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 洋蔥種子浸泡方法與時(shí)間 對洋蔥種子進(jìn)行以下3種不同的浸泡處理：a）在含洗滌劑的溫水中浸泡10 h;b）在不含洗滌劑的溫水中浸泡10 h;c）在不含洗滌劑的溫水中浸泡20 h。預(yù)處理后的種子先用70%酒精進(jìn)行體表消毒1 min，用無菌水沖洗3次后，再用0.1%的HgCl2（HgCl2溶液中按10 000∶1的比例添加Tween 20）消毒10 min，最后再用無菌水沖洗3～4次后接種在培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，pH 5.91，下同）中。對照是不做任何處理，直接接種。每個(gè)處理100粒種子。接種后先暗培養(yǎng)2 d，之后培養(yǎng)在室溫25 ℃下，光照15 h·d-1，10 d后統(tǒng)計(jì)污染及發(fā)芽狀況。

1.2.2 3種不同殺菌劑處理 在培養(yǎng)基中分別加入3種殺菌劑：多菌靈、甲基托布津、代森錳鋅，每種培養(yǎng)基設(shè)2個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別是1.2 g·L-1和2.4 g·L-1，搖勻，分裝，常規(guī)高壓滅菌。對照不加任何殺菌劑。每個(gè)處理100粒種子。先用70%酒精進(jìn)行體表消毒1.5 min，用無菌水沖洗3次后，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，最后再用無菌水沖洗3～4次。培養(yǎng)條件同上。10 d后統(tǒng)計(jì)污染及發(fā)芽狀況。

1.2.3 不同消毒時(shí)間處理 用70%酒精分別處理1.5、2.0、2.5 min，用10%的次氯酸鈉分別處理10、15、20 min，用無菌水沖洗過后接入培養(yǎng)基中，10 d后統(tǒng)計(jì)污染及發(fā)芽狀況。

為了應(yīng)用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)（響應(yīng)面法）進(jìn)行分析，對不同消毒時(shí)間處理進(jìn)行水平編碼，見表1。

對因素xj的各個(gè)水平進(jìn)行線性變換，得到水平的編碼z j =[xj-xj0Δ j]。其中，xj是j因素真實(shí)水平值，xj0是j因素0水平真實(shí)值，Δj是j因素1水平真實(shí)值減去0水平真實(shí)值的差值。

1.2.4 不同消毒液處理 將種子用70%酒精進(jìn)行體表消毒1.5 min，用無菌水沖洗3次后，用3種不同的方法處理洋蔥種子：a）10%次氯酸鈉消毒10 min;b）0.1% HgCl2消 毒10 min;c）0.1% HgCl2和Tween 20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min。之后再用無菌水沖洗3～4次，接種在培養(yǎng)基中。10 d后統(tǒng)計(jì)污染及發(fā)芽狀況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 對于洋蔥種子浸泡方法與時(shí)間、3種不同殺菌劑處理、不同消毒液處理，采用“多個(gè)樣本率的多重比較”[6]，所有組間采用k×2（k為組數(shù)）聯(lián)列表χ2檢驗(yàn)，對任2組間，采用四格表法檢驗(yàn)。兩組間的檢驗(yàn)率為α'。

α'=[αC2k+1]? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

k為比較的樣本率個(gè)數(shù)，即相互比較的實(shí)驗(yàn)組數(shù)。α為所有組間的總體檢驗(yàn)率，一般要求α=0.05。

不同消毒時(shí)間處理，采用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)（響應(yīng)面法）分析。使用軟件為SPSS 18.0和Design-Expert 8.0.

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥種子浸泡方法與時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)果見表2。3種不同浸泡方法與時(shí)間，與對照組比較，污染率顯著降低，但發(fā)芽率表現(xiàn)不同，b組發(fā)芽率與對照組沒有明顯差異，a、c處理發(fā)芽率顯著降低。

對表2 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果見表2最后兩列。浸泡方法與時(shí)間對污染率、發(fā)芽率都有顯著影響，污染率僅對照組與a、b、c有顯著差異，而a、b、c間無顯著差異;發(fā)芽率，僅對照與b無顯著差異，其他組間相互都有顯著差異。

綜合統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，最理想的處理為b組，即在不含洗滌劑的溫水中浸泡10 h，此時(shí)污染率低，發(fā)芽率高。

2.2 3種不同殺菌劑對洋蔥種子的影響

表3表明，不同殺菌劑對污染率變化影響不大，但對發(fā)芽率變化影響大，比對照組顯著降低了。

對表3進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果見表3最后2列。3種不同殺菌劑處理對洋蔥種子污染率沒有顯著影響，但對發(fā)芽率有顯著影響，對照組與其他處理組間有顯著差異，其他處理組間無顯著差異。綜合分析表明，最佳處理為對照組，即不添加任何殺菌劑。

2.3 不同消毒時(shí)間對洋蔥種子的影響

試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4，不同組合試驗(yàn)方案發(fā)芽率、污染率不同，變化較大，說明兩因素對試驗(yàn)結(jié)果可能存在顯著影響。

對表4中的污染率進(jìn)行方差分析（表5），二次回歸模型具有極顯著性，影響因素A（70%酒精）、影響因素A、B交互項(xiàng)AB、影響因素A平方項(xiàng)A2影響不顯著，影響因素B（10%次氯酸鈉）、影響因素B平方項(xiàng)B2影響極顯著。污染率y1與70%酒精處理時(shí)間（x1）、10%次氯酸鈉處理時(shí)間（x2）的回歸模型：

y1=-31.905 00+5.976 67 x1+14.771 67 x2+0.362 00 x1x2-5.760 00 x12-0.590 80 x22，預(yù)測值見表4，圖形見圖1。

由于影響因素B（10%次氯酸鈉處理）對污染率影響顯著，B因素3組間（處理時(shí)間10、15、20 min）多重比較表明：20 min 處理與10 min處理、15 min處理有顯著差異，10 min處理與15 min處理無顯著差異，10%次氯酸鈉處理時(shí)間不應(yīng)超過15 min。

對表4中發(fā)芽率進(jìn)行方差分析的結(jié)果（表6）表明，二次回歸模型具有顯著性，影響因素A（70%酒精）、影響因素A、B交互項(xiàng)AB、影響因素A平方項(xiàng)A2、影響因素B平方項(xiàng)B2影響不顯著，影響因素B（10%次氯酸鈉）影響極顯著。發(fā)芽率y2與70%酒精處理時(shí)間（x1）、10%次氯酸鈉處理時(shí)間（x2）的回歸模型：

y2=57.533 33-8.146 67 x1+2.322 33 x2-0.144 00 x1x2+0.040 000 x12-0.176 20 x22，預(yù)測值見表4，圖形見圖2。

由于影響因素B（10%次氯酸鈉處理）對發(fā)芽率影響顯著，B因素3組間（處理時(shí)間10、15、20 min）多重比較表明：3組相互間都有顯著差異，隨處理時(shí)間的增加發(fā)芽率顯著下降，特別是20 min時(shí)，下降明顯，10%次氯酸鈉處理時(shí)間不應(yīng)超過15 min。

污染率y1預(yù)測值越小越好，發(fā)芽率y2預(yù)測值越大越好，軟件綜合分析獲得最佳試驗(yàn)條件為：70%酒精處理時(shí)間（x1）2 min，10%次氯酸鈉處理時(shí)間（x2）10 min時(shí)，洋蔥種子發(fā)芽率44.12%，污染率52.89%。

2.4 不同消毒液處理結(jié)果及分析

不同消毒液處理結(jié)果見表7。b、c處理與a處理比較，能顯著降低污染率，同時(shí)也降低發(fā)芽率，但對發(fā)芽率的影響不是很明顯。

對表7進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，見表7最后兩列，分析表明，不同消毒液處理對發(fā)芽率沒有顯著影響，對污染率有顯著影響，a與b、c有顯著差異，b與c間無顯著差異。

綜合統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，最理想的處理為c組，即0.1%HgCl2和Tween 20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min。

3 討論與結(jié)論

王仲等[7]研究表明，洗滌劑對翠菊種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，隨著處理濃度和處理時(shí)間的增加，抑制作用明顯增強(qiáng)。本研究也表明不含洗滌劑的溫水處理發(fā)芽率最高。

李翠翠等[8]研究表明，一定浸泡時(shí)間內(nèi)，文定果種子的平均發(fā)芽率和平均發(fā)芽勢隨浸種時(shí)間的增加而增加，當(dāng)浸種時(shí)間過長時(shí)，大量的水分阻隔了氧氣，種子無法進(jìn)行呼吸作用，使其缺少了萌發(fā)必要的物質(zhì)和能量，導(dǎo)致萌發(fā)滯后，發(fā)芽率降低。本研究也表明在不含洗滌劑的溫水中浸泡10 h發(fā)芽率最高，浸泡20 h發(fā)芽率反而降低。

丁成龍等[9]研究表明，多菌靈濃度過高有抑制種子發(fā)芽的可能;朱茜等[10]研究表明，代森錳鋅劑量過高對蔬菜種子的萌發(fā)具有一定的抑制作用;甲基硫菌靈是一種廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑，浸泡種子后被植物種子吸收轉(zhuǎn)化為多菌靈，它主要通過干擾病菌菌絲形成和細(xì)胞分裂，使細(xì)胞壁中毒、孢子萌發(fā)畸形而殺死病菌，提高種子活力和發(fā)芽率，但其濃度過高，對發(fā)芽率有一定的抑制作用[11]。孫玉河等[12]的研究卻表明，40%多菌靈處理的黃瓜種子發(fā)芽率為69.6%，高于空白對照的66%，但不顯著。本研究也表明添加殺菌劑雖然可以降低污染率，但并不顯著，反而顯著降低了發(fā)芽率。本研究及文獻(xiàn)都表明，雖然多菌靈、甲基硫菌靈、代森錳鋅不同的濃度對不同的種子發(fā)芽率影響不同，但濃度高于一定標(biāo)準(zhǔn)（對不同蔬菜種子而言）都會抑制種子的發(fā)芽率，即使提高發(fā)芽率，也并不明顯。

種子消毒不僅要把表面的微生物殺死，而且不能傷害其組織和表層細(xì)胞，以獲得不污染且存活率較高的外植體。董飛等[13]研究表明，2%次氯酸鈉處理的大蔥種子發(fā)芽率顯著高于0.1% HgCl2處理，但2%次氯酸鈉處理的大蔥種子污染率也顯著高于0.1% HgCl2處理，與本研究基本相似。但本研究還表明在0.1%HgCl2中按照10 000∶1比例添加Tween 20后的混合溶液，既可以提高洋蔥種子的發(fā)芽率，同時(shí)又可以顯著降低洋蔥種子的污染率，是最為理想的消毒處理方案。

用70%酒精分別處理1.5、2.0、2.5 min，用10%的次氯酸鈉分別處理 10、15、20 min，進(jìn)行全面組合試驗(yàn)，二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)（響應(yīng)面法）分析表明，影響因素A（70%酒精處理）對洋蔥種子污染率、發(fā)芽率影響不顯著，影響因素B（10%次氯酸鈉處理）對洋蔥種子污染率、發(fā)芽率影響顯著，污染率y1、發(fā)芽率y2分別與70%酒精處理時(shí)間（x1）、10%次氯酸鈉處理時(shí)間（x2）存在顯著的二次回歸模型：

y1=-31.905 00+5.976 67 x1+14.771 67 x2+0.362 00 x1x2-5.760 00 x12-0.590 80 x22;

y2=57.533 33-8.146 67 x1+2.322 33 x2-0.144 00 x1x2+0.040 000 x12-0.176 20 x22。

污染率y1預(yù)測值越小越好，發(fā)芽率y2預(yù)測值越大越好，軟件綜合分析獲得最佳試驗(yàn)條件為：70%酒精處理時(shí)間（x1）2 min，10%次氯酸鈉處理時(shí)間（x2）10 min，洋蔥種子發(fā)芽率44.12%，污染率52.89%。

由于蔬菜生長過程中發(fā)生的病害多由種子攜帶病菌引起，因此，播前對蔬菜種子進(jìn)行消毒，可有效地減輕作物生長期間病害的發(fā)生[14-15]。杜燕等[16]比較了HgCl2、次氯酸鈉及H2O2對油菜種子的消毒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%次氯酸鈉處理效果較好。崔學(xué)晨等[17]采用2%NaOH、KMnO4、紫外線、CuSO4等對生菜、油麥菜、大葉苦苣和韭菜等種子進(jìn)行消毒處理，結(jié)果表明不同消毒方式對不同品種蔬菜種子發(fā)芽率和消毒效果的影響不同。因此本研究結(jié)果對于洋蔥種子的消毒處理，具有重要的參考價(jià)值。

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