丹酚酸B 抑制波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡

趙夢(mèng)秋 任尤楠 陶善珺 鄭書國(guó)*

（1.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)教研室，安徽 池州247009； 2.皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 蕪湖241002）

糖尿病及其心血管并發(fā)癥的發(fā)病率和致死率近年來(lái)持續(xù)上升，是威脅人類健康的一大殺手［1］。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的一種嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，疾病早期就能觀察到結(jié)構(gòu)與功能障礙［2］，心肌細(xì)胞凋亡是其主要的病理特征之一。DCM 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多種因素如高血糖、胰島素抵抗、代謝紊亂等可通過(guò)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣調(diào)節(jié)受損、線粒體功能障礙等各種途徑促使心肌細(xì)胞凋亡［3］，其中高血糖發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，血糖波動(dòng)可能是糖尿病患者早期心功能異常的危險(xiǎn)因素［4］，血糖波動(dòng)可引起比持續(xù)高糖更嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，如心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，使心肌細(xì)胞凋亡增加［5］。

作為傳統(tǒng)中藥丹參中提取出來(lái)的一種活性化合物，丹酚酸B 的心臟保護(hù)作用在多種模型上得到驗(yàn)證［6?7］。然而丹酚酸B 是否能夠減輕波動(dòng)高血糖造成的心臟損傷，延緩DCM 進(jìn)程尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在糖尿病大鼠模型上通過(guò)人工干預(yù)造成一日內(nèi)血糖水平大幅波動(dòng)，并觀察丹酚酸B 對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物與飼料 雄性SD 大鼠，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2014?0001；高糖高脂飼料（含豬油10%、蔗 糖10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、普通飼料74%），購(gòu)于南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑 丹酚酸B（純度80%，HK201410），購(gòu)于西安文竹生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（STZ，1126C028），購(gòu)于美國(guó) Sigma 公 司；普通胰島素（2141D2D9），購(gòu)于江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司；Bcl?2一抗（AF6139）、Bax 一抗（AF0120），購(gòu)于上海玉博生物科技有限公司；β?actin 抗體（ab8226）購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司；二抗（DXWB048）、蛋白定量試劑盒（DXWB010）購(gòu)于上海代軒生物科技有限公司；天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）3 檢測(cè)試劑盒（CK?E30186R）、磷酸肌酸激酶（CK?MB）試劑盒（CK?E90320R）購(gòu)于蘇州卡爾文生物科技有限公司；TUNEL 檢測(cè)試劑盒（11684817910）購(gòu)于瑞士羅氏公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 血糖儀購(gòu)于長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司；全功能發(fā)光儀器購(gòu)于上海復(fù)日科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于北京普朗新技術(shù)有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)于杭州奧盛儀器有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于北京六一儀器廠；熒光顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠血糖波動(dòng)模型制備與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10 只大鼠作正常組，喂以普通飼料，其余大鼠給予高糖高脂飼料。4 周后，禁食12 h，按40 mg／kg一次性腹腔注射STZ 制備糖尿病模型。繼續(xù)喂養(yǎng)7 d 后以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol／L 為模型制備成功。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、丹酚酸B 高劑量組及丹酚酸B 低劑量組。模型組和丹酚酸B 給藥組繼續(xù)喂飼高脂飼料，于每日8∶00 及18∶00 檢測(cè)血糖值，并根據(jù)血糖水平，選擇皮下注射普通胰島素6～9 U（隨機(jī)血糖≥16.7 mmol／L）或灌胃給予葡萄糖2 g／kg（隨機(jī)血糖＜16.7 mmol／L），造成1 日內(nèi)血糖水平大幅度波動(dòng)模型［8］。丹酚酸B 給藥組同時(shí)灌胃給予丹酚酸B 160 mg／kg 和80 mg／kg，連續(xù)6 周。

2.2 大鼠空腹血糖及血糖波動(dòng)水平檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前檢測(cè)一日內(nèi)各組大鼠8：00、12：00、16：00、18：00 和20：00 血糖值計(jì)算最大血糖波動(dòng)幅度（LAGE），禁食12 h 后測(cè)定空腹血糖。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，戊巴比妥鈉（30 mg／kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取出心臟。取相同部位心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片，EDTA 抗原修復(fù)緩沖液微波抗原修復(fù)，10%兔血清封閉后按TUNEL 試劑盒要求加入凋亡檢測(cè)反應(yīng)液，DAPI 染液復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片。切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)分離血清，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠CK?MB 水平。取心肌組織制備10%組織勻漿，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定caspase?3，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。

2.5 心肌組織Bcl?2、Bax 蛋白表達(dá)檢測(cè) RIPA 裂解液提取心肌組織總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后依次加入一抗及二抗孵育，ECL 顯色，全功能發(fā)光儀檢測(cè)分析結(jié)果。以與內(nèi)參蛋白光密度的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS 1.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹酚酸B 對(duì)大鼠空腹血糖和最大血糖波動(dòng)幅度的影響 由表1 可見，模型組大鼠空腹血糖及最大血糖波動(dòng)幅度較正常組大鼠均升高（P＜0.01），表明糖尿病血糖波動(dòng)模型造模成功。丹酚酸B 給藥組大鼠空腹血糖比模型組大鼠降低（P＜0.05，P＜0.01），但對(duì)血糖波動(dòng)無(wú)明顯影響。

表1 丹酚酸B 對(duì)大鼠空腹血糖及最大血糖波動(dòng)幅度的影響（， n＝7）

表1 丹酚酸B 對(duì)大鼠空腹血糖及最大血糖波動(dòng)幅度的影響（， n＝7）

注：與正常組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 丹酚酸B 對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響圖1 為TUNEL 法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡圖片。DAPI 染色細(xì)胞核，顯示藍(lán)色熒光，F(xiàn)ICT 顯示綠色熒光，該熒光提示細(xì)胞凋亡。圖片顯示正常組大鼠心肌細(xì)胞凋亡極少，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量最多，丹酚酸B 給藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡減少。

圖1 丹酚酸BP 對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL， ×200）

3.3 丹酚酸B 對(duì)糖尿病大鼠血清CK?MB 水平影響 如圖2 所示，糖尿病大鼠血清CK?MB 水平較正常組升高（P＜0.01），說(shuō)明波動(dòng)高糖造成了糖尿病大鼠心肌細(xì)胞損傷。丹酚酸B 給藥組血清CK?MB 水平降低（P＜0.01），提示丹酚酸B 可減輕糖尿病大鼠心肌細(xì)胞損傷。

圖2 丹酚酸B 對(duì)大鼠血清CK?MB 水平的影響（n＝7）

3.4 丹酚酸B 對(duì)糖尿病大鼠心肌組織caspase?3 表達(dá)的影響 糖尿病大鼠心肌組織caspase?3 表達(dá)比正常組升高（P＜0.01），而丹酚酸B 給藥后上述指標(biāo)降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 丹酚酸B 對(duì)大鼠心肌組織caspase?3 水平的影響（n＝7）

3.5 丹酚酸B 對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Bcl?2、Bax 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，糖尿病大鼠心肌組織Bcl?2 蛋白表達(dá)比正常組減少，而Bax 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01），丹酚酸B 給藥能夠改善這種趨勢(shì)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 丹酚酸B 對(duì)大鼠心肌組織Bcl?2 及Bax蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

4 討論

心肌細(xì)胞凋亡是DCM 主要病理特征之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)在DCM 發(fā)病過(guò)程中，心肌細(xì)胞凋亡和心功能不全相互促進(jìn)，最終發(fā)展為心力衰竭。心肌細(xì)胞異常凋亡數(shù)量增加，可導(dǎo)致心肌有效收縮單元不斷減少，從而影響心臟功能。而心功能不全造成心臟射血功能降低，導(dǎo)致心肌缺血缺氧，進(jìn)一步加劇心臟神經(jīng)?內(nèi)分泌功能失調(diào)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生［10］。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡是延緩DCM 的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)中，課題組在糖尿病大鼠模型上構(gòu)建了血糖波動(dòng)模型，并觀察到模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)血清CK?MB 水平升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11?13］。丹酚酸B 給藥組大鼠心肌凋亡數(shù)量及血清CK?MB 水平均降低，提示丹酚酸B 對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡有改善作用。

DCM 心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)都是引起心肌細(xì)胞凋亡的重要原因。在眾多參與凋亡調(diào)控的基因中，Bcl?2 家族是一種重要的調(diào)控因子［14］。Bcl?2 和Bax 在凋亡過(guò)程中發(fā)揮的功能是對(duì)立的，Bcl?2 作為抗凋亡因子，其同源二聚體有助于維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，而Bax 則發(fā)揮著促凋亡的作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，Bcl?2 與Bax 的比值降低，Bcl?2 對(duì)Bax 的抑制作用減弱，Bax 通過(guò)寡聚化插入到線粒體外膜，造成線粒體膜通透性增加［15］，從而促發(fā)凋亡。caspase 是一種促使細(xì)胞凋亡的酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)能被包括Bcl 家族在內(nèi)的多種凋亡信號(hào)調(diào)控。caspase?3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的終末剪切酶，是細(xì)胞凋亡的有力執(zhí)行者，可通過(guò)催化細(xì)胞基質(zhì)裂解，加速細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到波動(dòng)高血糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加的同時(shí)，Bcl?2 蛋白表達(dá)減少，Bax 與caspase?3 表達(dá)增加，而丹酚酸B 給藥能夠上調(diào)Bcl?2 的表達(dá)，抑制Bax 與caspase?3 表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示丹酚酸B 對(duì)心肌的保護(hù)作用可能與增加Bcl?2 的表達(dá)、抑制Bax 與caspase?3 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，丹酚酸B 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl?2 與Bax 表達(dá)抑制波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。