中藥復(fù)方口服制劑腸吸收評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

周 悅馬麗霞陳 軍董 潔顧 薇潘金火嚴(yán)國(guó)俊

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023）

近年來(lái)，以臨床效應(yīng)為導(dǎo)向的中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)越來(lái)越受到關(guān)注，其影響因素眾多，除了具有復(fù)雜的化學(xué)成分外，體內(nèi)吸收代謝等過程也很重要。口服制劑通過胃腸道上皮細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液循環(huán)，小腸作為藥物吸收的主要部位，腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)酶對(duì)藥物的代謝及屏障作用、藥物對(duì)小腸上皮中多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的特異性等均影響其生物利用度［1］。

目前，關(guān)于中藥口服制劑腸吸收的研究仍以指標(biāo)性成分含量居多，但該方法忽略了中藥成分復(fù)雜、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特征，不具有整體性和科學(xué)性。本文總結(jié)了中藥復(fù)方制劑腸吸收評(píng)價(jià)的常用方法（如體內(nèi)法、在體法、體外法等），遵循了中醫(yī)藥整體觀思想，以期探尋能體現(xiàn)其整體效應(yīng)的腸吸收評(píng)價(jià)方法。

1 中藥腸吸收實(shí)驗(yàn)方法

1.1 體內(nèi)法 體內(nèi)法是以整體動(dòng)物為研究對(duì)象，口服給藥后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)采集生物樣品血液或尿液等，測(cè)定藥液濃度，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，包括血藥濃度法、藥理效應(yīng)法、毒理效應(yīng)法、微生物測(cè)定法等［2］，以血藥濃度法較常用，適用于已知活性成分的中藥單體藥動(dòng)學(xué)研究，如趙文龍等［3］采用LC?MS／MS 法測(cè)定分別灌胃給予大鼠蒼柏納米乳、蒼術(shù)黃柏提取物混懸液后血漿樣品中鹽酸小檗堿濃度。雖然體內(nèi)法能提供藥物口服吸收后的真實(shí)體內(nèi)環(huán)境，但由于它綜合了生理、物化、劑型等眾多原因，不能特異反映腸道對(duì)藥物的吸收，而且動(dòng)物個(gè)體差異大，影響因素多，實(shí)驗(yàn)操作周期長(zhǎng)，導(dǎo)致很少應(yīng)用于藥物吸收機(jī)制研究。

1.2 在體法 在體法包括體腸灌流法、腸襻法、腸道血管插管法等［4］，在整體動(dòng)物建立的基礎(chǔ)上保證腸道神經(jīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)完整性，也保證了血液、淋巴液供應(yīng)，與體內(nèi)法相比，其干擾因素大大減小，能觀察藥物在真實(shí)腸環(huán)境下的吸收水平。其中，體腸灌流法應(yīng)用較廣泛，根據(jù)灌流方式不同可分為循環(huán)灌流法、單向灌流法、振動(dòng)灌流法等［5］，基本操作方法是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后開腹，在神經(jīng)、血管不切斷的條件下腸腔插管，洗凈內(nèi)容物，插管與恒流泵連接以使藥液在腸腔內(nèi)灌流，但它對(duì)藥物吸收率的測(cè)定較困難，由于在灌流過程中腸道不僅會(huì)吸收藥物，也會(huì)吸收或分泌水分，故需要對(duì)灌流液體積和密度進(jìn)行校正，常用校正方法主要有標(biāo)示物法、重量法，由于前者容易帶來(lái)實(shí)驗(yàn)誤差，故目前大多采用后者。

1.3 體外法 常用的體外法有外翻腸囊法、體外擴(kuò)散池法、細(xì)胞模型法、平行人工膜滲透模型（PAMPA）等，操作方法是剝離出動(dòng)物腸黏膜／腸段，或采用培養(yǎng)的細(xì)胞模型／仿生膜模擬腸環(huán)境對(duì)藥物進(jìn)行腸吸收評(píng)價(jià)。通常，先利用體外法考察藥物的吸收部位與吸收機(jī)制。

1.3.1 外翻腸囊法 外翻腸囊法是將禁食12 h（自由飲水）的小鼠處死后選取所需腸段洗凈，剝?nèi)ザ嘤嘀窘M織，腸段一端系在玻璃棒上，翻轉(zhuǎn)后使之成囊狀結(jié)扎另一端，放入緩沖液一段時(shí)間后加入藥物，于不同時(shí)間點(diǎn)從腸囊內(nèi)取樣測(cè)定。陳寶婷等［6］建立大鼠腸外翻模型后，采用UPLC 法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)芒果苷在腸囊內(nèi)的濃度，考察該成分在腸段中的最佳吸收部位，研究知母、知母?黃柏、P?糖蛋白抑制劑對(duì)其吸收的影響；孔小強(qiáng)等［7］采用外翻腸囊模型，對(duì)黃芪?附子配伍對(duì)附子6種生物堿腸吸收的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黃芪可抑制附子生物堿的吸收，而且其抑制作用與配伍比例、生物堿種類、腸段部位有關(guān)。該方法藥液用量少，藥物積累快，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易控制，但沒有神經(jīng)和血液的供應(yīng)，導(dǎo)致腸囊會(huì)因離體時(shí)間太長(zhǎng)而失去活性，而且在翻轉(zhuǎn)腸段的過程中易造成細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變而影響腸段通透性，實(shí)驗(yàn)中也應(yīng)注意控制時(shí)長(zhǎng)。

1.3.2 細(xì)胞模型法細(xì)胞模型法是一種在細(xì)胞或分子層面上研究腸吸收的模型，主要有Caco?2、HT29?MTX、MDCK細(xì)胞模型，以Caco?2細(xì)胞模型應(yīng)用更廣泛，它來(lái)源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞系，在細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)板（Transwell）培養(yǎng)中可分化成與人成熟小腸上皮相類似的單層細(xì)胞，并且含有小腸上皮相關(guān)的酶，能模擬小腸上皮細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其建立需要經(jīng)過細(xì)胞的培養(yǎng)和評(píng)價(jià)，包括形態(tài)學(xué)觀察、跨膜電阻值（TEER）測(cè)定、穩(wěn)定性考察、通透性驗(yàn)證等［8?10］。胡強(qiáng)等［11］采用Caco?2細(xì)胞模型研究四制香附主成分在腸吸收機(jī)制，可為相關(guān)臨床應(yīng)用和劑型設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)；周本宏等［12］建立Caco?2細(xì)胞模型，研究時(shí)間、溫度、pH值、P?糖蛋白抑制劑（維拉帕米和環(huán)孢菌素）對(duì)安石榴苷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。Caco?2細(xì)胞來(lái)源于人體，同源性好，相比于動(dòng)物模型更易操作，重復(fù)性更高，但該方法也存在缺點(diǎn)，如培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、易污染等，而且Caco?2 作為單層細(xì)胞缺少主要吸收屏障之一的黏膜層，也缺少小腸上皮細(xì)胞特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶。目前，將Caco?2 與其他細(xì)胞如產(chǎn)生黏液HT29?MTX 共同培養(yǎng)，從而優(yōu)化了腸屏障建立［13］。

1.3.3 平行人工膜滲透模型（PAMPA）將含有卵磷脂的惰性有機(jī)溶液涂布在聚偏氟乙烯或者聚碳酸脂膜上，卵磷脂能在96 孔微滴板中形成非常穩(wěn)定的雙層膜，利用這種在支撐材料上成膜的性質(zhì)建立了PAMPA 模型，用于模擬口服藥物在胃腸道中的被動(dòng)擴(kuò)散吸收情況［14］。韓旻等［15］將PAMPA 模型和大鼠體內(nèi)腸吸收模型進(jìn)行比較，研究三七總皂苷油包水微乳體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及體外對(duì)膜流動(dòng)性和藥物膜轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)的影響。該模型具有高通量、低成本、檢測(cè)手段方便、靈活性高等優(yōu)點(diǎn)，是藥物生物膜吸收的理想模型，但它只有單一的被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制，無(wú)法精確預(yù)測(cè)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對(duì)親脂性的小分子化合物無(wú)法明確是由旁細(xì)胞滲透途徑，還是被動(dòng)擴(kuò)散途徑穿過細(xì)胞膜。目前，將PAMPA 與Caco?2細(xì)胞、MDCK細(xì)胞模型聯(lián)用，可避免以上問題［16］。

1.3.4 體外擴(kuò)散池法 體外擴(kuò)散池法具有實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、易操作等優(yōu)勢(shì)，在研究藥物腸吸收和代謝方面有著廣泛應(yīng)用，其基本操作方法是將分離出來(lái)腸段或腸黏膜夾在擴(kuò)散池中間，加入適量緩沖液，通入空氣進(jìn)行攪拌或利用電磁攪拌藥液，供應(yīng)室投放藥液，藥液透過腸膜在接受室中收集，在不同時(shí)間段取樣檢測(cè)藥物的累積量［17］。擴(kuò)散池依據(jù)結(jié)構(gòu)特征，有水平、垂直2種［18］，國(guó)內(nèi)外有利用垂直擴(kuò)散池（Franz）研究藥物的透皮吸收能力［19］和腸吸收的機(jī)制［20?21］，因其操作簡(jiǎn)單，更為經(jīng)濟(jì)，可作為替代Caco?2細(xì)胞的腸吸收試驗(yàn)方法［22］；水平擴(kuò)散池在市面上有Valia?Chien 擴(kuò)散池或side?bi?side 擴(kuò)散池，目前主要研究藥物的透皮吸收能力，如口腔給藥［23］、眼部給藥［24］等，也可進(jìn)行藥物腸吸收實(shí)驗(yàn)［25?26］或與Caco?2細(xì)胞模型聯(lián)用［27?28］。

尤斯灌流室法（Ussing Chamber）是另一種體外擴(kuò)散池法，具有灌流室和電路系的特殊結(jié)構(gòu)，首先是由丹麥學(xué)者Hans H.Ussing 研究上皮組織離子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而建立的，之后在藥學(xué)、畜禽營(yíng)養(yǎng)、生理學(xué)等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛運(yùn)用［29?30］，該系統(tǒng)主要由兩部分構(gòu)成，即灌流室、電路系統(tǒng)，具有2種灌流方式，即循環(huán)式、持續(xù)式。Wang 等［31］利用尤斯灌流室法，對(duì)黃芩和虎杖經(jīng)腸吸收后的活性黃酮類化合物進(jìn) 行篩選和測(cè)定；趙博欣等［32］采 用Ussing Chamber 擴(kuò)散池，研究芹菜素與柏皮素分別經(jīng)大鼠空腸、回腸與結(jié)腸黏膜的吸收情況。與上述2種擴(kuò)散池法相比，尤斯灌流室法的優(yōu)點(diǎn)為①研發(fā)出各種尺寸的樣本夾，如大、小鼠腸段，皮膚或固定細(xì)胞培養(yǎng)插件等；②儀器設(shè)備齊全，電路系統(tǒng)可測(cè)定腸黏膜的跨上皮電壓（transepi?thelial voltage，Vt）、短路電流（short?circuit current，Isc）、組織阻抗（resistance，Rt）等，可反映組織活性，如當(dāng)腸黏膜的Vt＜4 mV 時(shí)，則被認(rèn)為是活性弱的組織，表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠；③U 形管可以保證兩側(cè)相同的流體靜壓，從而避免彎曲損壞組織［33］。具體裝置［34］見圖1。

圖1 尤斯灌流室法裝置圖

2 中藥復(fù)方口服制劑腸吸收評(píng)價(jià)方法

2.1 以化學(xué)成分為指標(biāo) 由于中藥單味藥、復(fù)方成分復(fù)雜，與藥效之間的關(guān)系尚不明確，目前仍普遍采用1種或幾種化學(xué)成分作為單味藥或全方的代表來(lái)開展腸吸收及藥動(dòng)學(xué)的研究，常用分析手段有紫外分光光度法、HPLC 法，或與HPLC 法聯(lián)用，如HPLC?UV、HPLC?DAD、HPLC?ELSD 法等。柏?；鄣龋?5］采用HPLC 法測(cè)定在體單向灌流液中薯蕷皂苷含量，分別考察不同腸段、藥物濃度、P?糖蛋白（P?gp）抑制劑對(duì)該成分吸收的影響；劉亞楠等［21］采用Franz 擴(kuò)散池法進(jìn)行參附提取液體外滲透實(shí)驗(yàn)，以人參皂苷、人參附子總多糖含量為指標(biāo)，通過紫外分光光度法測(cè)定參附提取液經(jīng)不同腸黏膜的透過率；許永崧等［36］采用HPLC?DAD 法對(duì)吳茱萸湯及外翻腸囊吸收樣品中9種成分進(jìn)行定量、半定量分析，得到各成分在吳茱萸湯中的含量及在腸囊中的累積吸收量。但上述方法不具有專屬性，忽略了中藥成分復(fù)雜、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特征，選取的“指標(biāo)”不一定是其專屬性成分，也不一定代表有效成分，不能從整體水平上評(píng)價(jià)中藥腸吸收的情況。

2.2 以指紋圖譜為指標(biāo) 中藥指紋圖譜作為一種半定量的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段，具有整體性和模糊性，在某種程度上符合中藥多組分、多靶點(diǎn)的臨床治療特點(diǎn)，較單一成分的指標(biāo)評(píng)價(jià)方法相比更具有全面性和科學(xué)性。李和偉等［37］采用離體大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊法對(duì)鴨跖草進(jìn)行腸吸收實(shí)驗(yàn)，以HPLC法構(gòu)建化學(xué)成分指紋圖譜，并與原藥液成分圖譜直接比照，進(jìn)行腸吸收成分定性指認(rèn)，作為后續(xù)吸收定量評(píng)價(jià)的成分鎖定基礎(chǔ)。但指紋圖譜會(huì)受色譜條件、化合物自身穩(wěn)定性、多組分在同一條件下適應(yīng)性等因素的影響，而且它雖然在一定程度上可表征中藥質(zhì)量，但本質(zhì)上仍使用單一分析方法和檢測(cè)手段，所得到的化學(xué)信息也是有限的［38］，并且所得整體化學(xué)成分的指標(biāo)與生物等效、臨床等效有無(wú)相關(guān)性還需驗(yàn)證。

2.3 以生物效應(yīng)為指標(biāo) 生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法是繼性狀評(píng)價(jià)、化學(xué)評(píng)價(jià)之后，推動(dòng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)走進(jìn)臨床、關(guān)聯(lián)療效的有效途徑和手段，該方法是以藥物生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，利用整體動(dòng)物、離體組織、器官、微生物和細(xì)胞、相關(guān)生物因子等為試驗(yàn)系，評(píng)價(jià)藥物有效性或毒性等生物活性，從而達(dá)到控制或評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的目的［38］。該方法特別適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜或理化方法不能測(cè)定其含量，或者理化測(cè)定不能反映其臨床生物活性的藥物，具有較強(qiáng)的專屬性，直接關(guān)聯(lián)中藥有效性與安全性，簡(jiǎn)單快速，符合中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀，在中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已在活血化瘀、宣肺平喘、抑菌、抗炎類等中藥質(zhì)量控制中得到廣泛應(yīng)用［39］。中藥作為多成分化合物的集合體，其吸收行為和規(guī)律各異，若只依據(jù)一種或多種化學(xué)成分進(jìn)行腸吸收研究，則無(wú)法綜合評(píng)價(jià)中藥復(fù)方吸收特征，而生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法可在不以化學(xué)成分為目標(biāo)的基礎(chǔ)上從整體出發(fā)，對(duì)中藥復(fù)方口服制劑進(jìn)行腸吸收機(jī)制評(píng)價(jià)，形成能反映中藥整體吸收規(guī)律的生物學(xué)綜合評(píng)價(jià)方法。將中藥腸吸收藥液作為化合物集合體直接作用于生物模型上時(shí)，產(chǎn)生一系列的相互作用過程，可形成可量化的生物效應(yīng)指標(biāo)值，從而獲得生物效應(yīng)值?吸收時(shí)間曲線，即可通過建立吸收動(dòng)力學(xué)模型來(lái)探討腸吸收機(jī)制，以此建立以生物活性為導(dǎo)向的中藥口服制劑腸吸收機(jī)制評(píng)價(jià)方法，從而彌補(bǔ)化學(xué)成分評(píng)價(jià)方法的缺陷。

目前，已有將體外腸道吸收與生物活性相結(jié)合的研究。黃斌等［40］采用外翻腸囊法制備元胡止痛方不同時(shí)間點(diǎn)的腸吸收液探究對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，發(fā)現(xiàn)血管舒張活性隨著腸吸收的時(shí)間明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出量?效、時(shí)?效關(guān)系；耿亞等［41］建立“腸外翻?心肌細(xì)胞”聯(lián)用模型探究益氣活血方腸吸收液的藥效作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)它對(duì)H9C2心肌細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，并隨著腸吸收液質(zhì)量濃度增加細(xì)胞活力會(huì)增強(qiáng)，存在一定劑量依賴性。

口服固體制劑需先經(jīng)過崩解、溶解成藥液后才能在胃腸段進(jìn)行吸收，溶出與吸收的方法雖然不一樣，但評(píng)價(jià)指標(biāo)和檢測(cè)技術(shù)可以相互借鑒，目前已經(jīng)有基于“量?效”相關(guān)性對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行體外溶出度生物效應(yīng)評(píng)價(jià)的研究［42?43］。馬曉斐等［43］基于細(xì)胞生物電傳感效應(yīng)對(duì)復(fù)方丹參片溶出動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察，采用實(shí)時(shí)電子分析技術(shù)（real?time cell?based assay，RTCA）監(jiān)測(cè)加入不同時(shí)間溶出藥液的H9C2心肌細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化（包括細(xì)胞增殖與分化、凋亡與衰老、黏附等多種細(xì)胞生理狀態(tài)），將電信號(hào)轉(zhuǎn)換成可定量的細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）以間接反映藥物對(duì)細(xì)胞的作用，并以此為依據(jù)評(píng)價(jià)藥物的生物活性，獲得復(fù)方丹參片的細(xì)胞指數(shù)?溶出時(shí)間曲線，發(fā)現(xiàn)與利用紫外分光光度法檢測(cè)得到的溶出度結(jié)果有較高相關(guān)性，與Weibull 模型相比，RTCA擬合的模型效果更佳。在建立體外腸吸收模型的基礎(chǔ)上，獲得中藥復(fù)方制劑的腸吸收藥液，應(yīng)用RTCA 技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同時(shí)間腸吸收藥液的細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，并得到其細(xì)胞指數(shù)?吸收時(shí)間曲線，即可建立一種以細(xì)胞指數(shù)為指標(biāo)的腸吸收動(dòng)力學(xué)模型考察吸收機(jī)制，這可彌補(bǔ)檢測(cè)一種或幾種化學(xué)指標(biāo)成分評(píng)價(jià)中藥口服制劑腸吸收機(jī)制的不足，給研究帶來(lái)了新啟發(fā)。

3 總結(jié)與展望

目前，中藥腸吸收的實(shí)驗(yàn)研究方法種類很多，大致分為體內(nèi)法、在體法、體外法，有各自特點(diǎn)和適用范圍。其中，體內(nèi)法以整體動(dòng)物為研究對(duì)象，由于綜合影響因素較大，不適用研究藥物的吸收機(jī)制，更傾向研究藥物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征；在體法在整體動(dòng)物的基礎(chǔ)上保證了血液、淋巴液的供應(yīng)及腸道神經(jīng)、內(nèi)分泌狀態(tài)的完好，并且降低了內(nèi)容物的干擾因素，但也存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異較大的問題，需要保證一定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量以降低差異；體外法是脫離整體動(dòng)物，選擇剝離的腸段或細(xì)胞模型進(jìn)行的腸道吸收研究，該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，可用于藥物早期高通量篩選，對(duì)腸道吸收機(jī)制的研究也較為方便。

目前，對(duì)中藥腸吸收評(píng)價(jià)方法以指標(biāo)性成分含量居多，利用其中單一或幾種成分作為單味藥或全方的代表進(jìn)行腸吸收動(dòng)力學(xué)研究，但并不具有整體性和科學(xué)性；采用中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)中藥腸吸收雖然可體現(xiàn)中藥部分整體性，但易受色譜條件、化合物自身穩(wěn)定性、多組分在同一條件適應(yīng)性等因素的影響，并且使用的是單一分析方法和檢測(cè)手段，所得到信息也是有限的。生物效應(yīng)評(píng)價(jià)方法作為繼性狀評(píng)價(jià)、化學(xué)評(píng)價(jià)后推動(dòng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)走進(jìn)臨床、關(guān)聯(lián)療效的有效途徑，但值得注意的是，該方法與指標(biāo)成分定量評(píng)價(jià)、指紋圖譜并不是替代與被替代的關(guān)系，而是相輔相成，應(yīng)利用其各自優(yōu)勢(shì)取長(zhǎng)補(bǔ)短，不斷完善對(duì)中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)。