基于UPLC?LTQ?Orbitrap 技術(shù)對腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分積累的動態(tài)分析

邵 堅(jiān)李詒光 謝 斌 陳 芳 周立分劉文君*

（1.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004）

腫節(jié)風(fēng)，又名竹節(jié)茶、接骨木，為金栗蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，主要分布于浙江、江西、安徽、福建、廣東、廣西等地［1］。腫節(jié)風(fēng)性平味苦辛，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，傳統(tǒng)用于血熱發(fā)斑發(fā)疹、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷［2］；其現(xiàn)代中藥制劑多用于治療各種炎癥，如咽喉炎、扁桃體炎、牙齦炎。腫節(jié)風(fēng)中化學(xué)成分主要為香豆素、有機(jī)酸、黃酮、倍半萜等，且均有抗炎活性［3?7］；其中，黃酮還具有抑制血小板凋亡、促進(jìn)白血病K562細(xì)胞凋亡和巨核細(xì)胞分化成熟等藥理作用［8?10］。

中藥質(zhì)量的優(yōu)劣取決于所含的有效成分群，后者隨著生長期的變化往往存在一定的差異［11］。本研究利用UPLC?LTQ?Orbitrap 對相同地理環(huán)境不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分進(jìn)行快速表征，進(jìn)一步采用組分技術(shù)分析不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分變化，以期為不同生長期腫節(jié)風(fēng)中化學(xué)成分積累動態(tài)規(guī)律提供參考，也為腫節(jié)風(fēng)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

ORBITRAP ELITE 質(zhì)譜儀、Dionex UitiMate 3000（美國Thermo Fisher 公司）；MSA224S 電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ1000KDE型數(shù)控超聲波清洗器（40 kHz，昆山市儀器超聲有限公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純級（德國Merck 公司）；甲酸（質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher 公司）；超純水（美國Millipore 公司）。

不同生長期腫節(jié)風(fēng)樣品于江西中醫(yī)藥大學(xué)神農(nóng)園采集，分別為3年生、5年生、8年生，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)朱玉野副教授鑒定為金栗蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai，不同生長期樣品各4 份，除去雜質(zhì)，曬干，備用。

2 方法

2.1 樣品制備 參考文獻(xiàn)［12］，取本品粉末（過3號篩）0.10 g，精密稱定，精密加入水5 mL，60 ℃水浴超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液備用；每份樣品平行制備2 次。QC（quality control）樣本由各待測樣品取等量混合而成。QC 樣本代表平均樣本，每5 針樣品進(jìn)一次QC 樣，用于數(shù)據(jù)的校正。

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相乙腈（A）?0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，5% A；1～18 min，5%～26%A；18～26 min，26%～100%A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 FT Orbitrap 檢測器，分辨率設(shè)為30 000，掃描范圍設(shè)為m／z100～800；ESI 離子源，噴霧電壓4.0 kV，管狀透鏡電壓110 V；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣體積流量30 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助氣體積流量10 psi；二級質(zhì)譜采用IDA 掃描（豐度最高的3個(gè)峰進(jìn)行CID 碎片掃描）。

2.3 數(shù)據(jù)處理 通過高分辨質(zhì)荷比、同位素豐度、Massbank 數(shù)據(jù)庫結(jié)合化合物本身裂解規(guī)律進(jìn)行腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分鑒定；進(jìn)一步將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Thermo sieve 軟件進(jìn)行去噪、峰對齊、峰識別等數(shù)據(jù)預(yù)處理，獲取數(shù)據(jù)矩陣；并將矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA?P 14.1（Umetrics，ume?，Sweden）軟件，將數(shù)據(jù)歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行正交偏最小二乘?判別分析（OPLS?DA）及化學(xué)成分關(guān)聯(lián)性分析。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分指認(rèn) 對比3年、5年、8年生長期的腫節(jié)風(fēng)總離子圖，可知不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分質(zhì)譜信息基本保持一致，但響應(yīng)強(qiáng)度有所差異，見圖1。

圖1 不同生長年期腫節(jié)風(fēng)總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms for S.glabra of different growth periods

根據(jù)QC 樣品中化學(xué)成分的高分辨質(zhì)譜信息、保留時(shí)間、二級裂解碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對腫節(jié)風(fēng)的主要成分進(jìn)行指認(rèn)，推斷鑒定出有機(jī)酸、黃酮、香豆素、倍半萜等成分，共31個(gè)化合物，見表1。

表1 腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.1 Results for identification of S.glabra constituents

3.2 主成分分析 將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA?P 進(jìn)行主成分分析，共得到3個(gè)主成分，累積R2X＝0.929，Q2＝0.906。見圖2，可知，3年生、5年生、8年生樣品均處于在置信區(qū)間內(nèi)，不同生長期樣品完全分開，可以明顯區(qū)分。

圖2 不同生長期樣品主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis plot for samples of different growth stages

3.3 OPLS?DA分析 參考文獻(xiàn)［13］，為了進(jìn)一步揭示不同生長期腫節(jié)風(fēng)內(nèi)在化學(xué)成分的差異性，采用OPLS?DA 篩選。結(jié)果見圖3，可知，3年生腫節(jié)風(fēng)樣品主要分布在置信區(qū)間的左側(cè)，5年生腫節(jié)風(fēng)樣品主要分布在置信區(qū)間的右側(cè)，可以明顯區(qū)分開；模型中3個(gè)參數(shù)的數(shù)值均大于0.5，OPLS?DA 模型可解釋能力好；進(jìn)一步對OPLS?DA 模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖4，隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的R2和Q2均逐漸下降，表明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性較好。結(jié)果見圖5，5年生腫節(jié)風(fēng)樣品主要分布在置信區(qū)間的左側(cè)，8年生腫節(jié)風(fēng)樣品主要分布在置信區(qū)間的右側(cè)，可以明顯區(qū)分開；模型中，3個(gè)參數(shù)的數(shù)值均大于0.5，OPLS?DA 模型可解 釋能力好；進(jìn)一步對OPLS?DA 模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖6，隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的R2和Q2均逐漸下降，表明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性較好。

圖3 3年生與5年生腫節(jié)風(fēng)OPLS?DA 得分圖Fig.3 OPLS?DA score for 3?year?old and 5?year?old S.glabra

圖4 置換檢驗(yàn)（1）Fig.4 Permutation test（1）

圖5 5年生與8年生腫節(jié)風(fēng)OPLS?DA 得分圖Fig.5 OPLS?DA score for 5?year?old and 8?year?old S.glabra

圖6 置換檢驗(yàn)（2）Fig.6 Permutation test（2）

通過OPLS?DA 模型中的VIP＞1.5、P＜0.01 篩選不同生長期腫節(jié)風(fēng)的差異成分。表2 顯示，篩選出3年生腫節(jié)風(fēng)、5年生腫節(jié)風(fēng)中14種差異成分，分別為綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、新落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、迷迭香酸、咖啡酸、柚皮素?6?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、柚皮素?8?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、槲皮素?3?O?β?D葡萄糖醛酸、山柰酚?3?O?β?D?吡喃葡萄糖醛酸苷、草珊瑚酚苷A；表3 顯示，篩選出5年生腫節(jié)風(fēng)與8年生腫節(jié)風(fēng)14種差異成分，分別為新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、6，7，8?三羥基香豆素?7?O?α?吡喃鼠李糖苷、柚皮素?6?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、柚皮素?8?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、新落新婦苷、槲皮素?3?O?β?D葡萄糖醛酸、落新婦苷、新異落新婦苷、山柰酚?3?O?β?D?吡喃葡萄糖醛酸苷、異落新婦苷、迷迭香酸；不同生長期的腫節(jié)風(fēng)差異成分基本一致，但相對含量差異較大。

表2 3年生與5年生腫節(jié)風(fēng)中差異成分Tab.2 Composition differences in 3?year?old and 5?year?old S.glabra

表3 5年生與8年生腫節(jié)風(fēng)中差異成分Tab.3 Composition differences in 5?year?old and 8?year?old S.glabra

3.4 差異成分相對含量變化趨勢分析 對不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分相對含量動態(tài)變化分析，有12種共有差異化學(xué)成分存在顯著性差異，結(jié)果見圖7，化學(xué)成分隨生長期呈顯不同的變化趨勢，綠原酸、隱綠原酸、新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、迷迭香酸相對含量隨年限增加而下降；而咖啡酸、柚皮素?6?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、柚皮素?8?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、槲皮素?3?O?β?D?葡萄糖醛酸、山柰酚?3?O?β?D?吡喃葡萄糖醛酸苷相對含量先上升而后下降。

圖7 不同生長期腫節(jié)風(fēng)差異成分變化規(guī)律Fig.7 Variation rule of differential compositions in S.Glabra at different growth stages

3.5 差異成分相關(guān)性分析圖8 顯示，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，顏色越深相關(guān)性越大，反之越小。不同生長期的腫節(jié)風(fēng)含量差異成分總體關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)；隱綠原酸、新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷等成分聚為一類，呈強(qiáng)正相關(guān)；綠原酸和迷迭香酸等成分聚為一類，呈強(qiáng)正相關(guān)；4?柚皮素?6?C?β?D?吡喃葡萄糖苷，5?柚皮素?8?C?β?D?吡喃葡萄糖苷等成分聚為一類，呈強(qiáng)正相關(guān)；咖啡酸、山柰酚?3?O?β?D?吡喃葡萄糖醛酸苷等成分聚為一類，呈強(qiáng)正相關(guān)。

圖8 腫節(jié)風(fēng)中化學(xué)成分關(guān)聯(lián)性分析Fig.8 Correlation analysis of chemical constituents in S.glabra

4 討論

該研究對腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，解析化合物的裂解規(guī)律共鑒定出31種化學(xué)成分，利用代謝組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同生長期腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分的整體評價(jià)。不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分差異明顯，通過OPLS?DA分析篩選出共有14種差異成分，且均為黃酮和有機(jī)酸，顯示生長期對腫節(jié)風(fēng)中的黃酮和有機(jī)酸成分富集影響較大。多數(shù)有機(jī)酸相對含量隨生長年限下降顯著，而咖啡酸相對含量先升后降，可能與咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、迷迭香酸的前體成分有關(guān)。黃酮相對含量則隨生長年限呈現(xiàn)不同的變化趨勢，其中酚苷（柚皮素?6?C?β?D?吡喃葡萄糖苷、柚皮素?8?C?β?D?吡喃葡萄糖苷）和黃酮苷酸（槲皮素?3?O?β?D?葡萄糖醛酸、山柰酚?3?O?β?D?吡喃葡萄糖醛酸苷）相對含量先升后降，二氫黃酮醇苷（新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷）相對含量則逐步下降。相關(guān)性分析表明，黃酮、有機(jī)酸均表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似成分呈強(qiáng)正相關(guān)，可能與具有相似的生物合成途徑有關(guān)。本研究借助LTQ?Orbitrap 技術(shù)對不同生長期腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分進(jìn)行動態(tài)分析，以期為深入研究生長期對腫節(jié)風(fēng)物質(zhì)基礎(chǔ)影響提供依據(jù)，同時(shí)也為腫節(jié)風(fēng)質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。