五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接損傷的保護作用及機制

馬瓊艷張長城楊 圓張 艷吳 杰袁 丁趙海霞

（三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌443002）

隨著社會經濟的高速發(fā)展和生活環(huán)境的變化，人們生育觀念發(fā)生轉變，男性平均生育年齡不斷提高，但臨床研究顯示，隨著年齡增加睪丸生精功能逐漸衰退［1］。睪丸支持細胞與精子發(fā)生密切相關，而由相鄰支持細胞組成的緊密連接對生精細胞移行有重要作用，衰老可致睪丸支持細胞功能衰退和緊密連接損傷，造成睪丸生精功能障礙［2］。研究顯示，雄性大鼠缺 失 Occludin（閉鎖蛋白）或Claudin?11（緊密連接蛋白）基因［3］，不能形成完整的緊密連接，導致生精功能障礙；在睪丸支持細胞中，p38MAPK 可將細胞外信號轉移至細胞內，與靶基因MMP?9 啟動子結合，MMP?9 蛋白表達增加，從而降解緊密連接蛋白，破壞血睪屏障完整性［4］。因此，抑制衰老睪丸支持細胞p38MAPK／MMP?9 通路活化，可能是減輕衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接損傷的重要措施之一。

五子衍宗方是傳統(tǒng)補腎生精的代表方，由覆盆子、枸杞子、車前子、菟絲子、五味子5種中藥組成，具有調節(jié)支持細胞功能、改善睪丸生精功能等藥理作用，可改善男性不育癥患者精液質量［5］，能通過改善支持細胞緊密連接超微結構來顯著增加ZO?1 和Occludin 蛋白表達，進而改善雷公藤多苷所致小鼠生精功能障礙［6］，還可通過下調p?p38MAPK 蛋白表達來改善環(huán)磷酰胺所致大鼠睪丸生精功能障礙［7］。方中枸杞多糖可通過降低血管內皮細胞MMP?9 活性，上調ZO?1、Occludin 蛋白表達，減輕細胞損傷［8］，但該方能否改善衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接損傷，機制是否與調節(jié)p38MAPK／MMP?9 通路相關尚不明確。因此，本實驗從改善衰老睪丸支持細胞緊密連接功能的角度，探討五子衍宗方改善衰老大鼠睪丸生精功能障礙的機制。

1 材料

1.1 動物 30 只2 月齡SPF 級雄性SD 大鼠喂養(yǎng)至16 月齡，另購買10 只2 月齡SPF 級雄性SD 大鼠，均購買并分籠飼養(yǎng)于三峽大學實驗動物中心動物房，動物生產許可證號SCXK（鄂）2012?0001，自由飲水進食，相對濕度（60±5）%，溫度（22±3）℃，12 h 晝夜交替環(huán)境。

1.2 試劑與藥物 五味子（批號15080702）、菟絲 子（批號15061901）、車前子（批號15063002）、枸杞子（批號15083002）、覆盆子（批號15071702）均購于宜昌市中醫(yī)醫(yī)院，經三峽大學何毓敏博士鑒定為正品，并根據2015年版《中國藥典》 五子衍宗丸配方，稱取枸杞子400 g、菟絲子400 g、車前子100 g、覆盆子100 g、五味子50 g，充分混勻后打成細粉末，30 g 低劑量（1 g／kg）飼料中加入0.8 g 藥物，30 g 高劑量（4 g／kg）飼料中加入3.2 g 藥物，送往飼料廠加工。β?actin（貨號GB11001）、ZO?1（貨號21773?1?AP）購于武漢谷歌生物技術有限公司；Claudin?11（貨號ab53041）購于英國 Abcam 公 司；Ocludin（貨號sc?5562）購于美國Santa Cruz 公司；SOX?9（貨號AB5535）購于美國Millipore 公司；MMP?9（貨號10375?2?AP）、p?p38MAPK（貨號530056）購于美國ZenBio 公司；山羊抗兔二抗購于武漢科瑞生物有限公司；Alexa Fluor 594 驢抗兔IgG（H＋L）（貨號140019）、Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG（H＋L）（貨號140422）購于美國Jackson Immuno Research 公司；ECL 顯影液購于武漢谷歌生物科技公司。

1.3 儀器 Power Pas Basic200 Western blot 電泳儀購于美國Bio?Rad 公司；A1R＋激光共聚焦顯微鏡購于日本Nikon 公司；IX53 倒置光學顯微鏡購于日本Olympus 公司；TP 102 自動脫水機、EG 1150C 超薄切片機、EG 1150H 石蠟包埋機購于德國Leica 公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 30 只大鼠隨機分為衰老模型組、五子衍宗方低劑量組（1 g／kg）、五子衍宗方高劑量組（4 g／kg），另取2 月齡SD 雄性大鼠作為青年對照組，每組10 只。依據2015年版《中國藥典》 五子衍宗丸的成人日服用量，通過大鼠、成人體質量面積換算，確定低、高劑量組大鼠分別給予1、4 g／kg 含藥飼料喂養(yǎng)，青年對照組、衰老模型組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，給藥4個月后麻醉處死大鼠，取出睪丸組織備用。

2.2 睪丸組織形態(tài)變化觀察 取各組大鼠睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，HE 染色，透明，晾干，中性樹脂封片，置于光學顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。去除睪丸組織病變和HE 染色異常編號后，每組取7～8個樣本，在光鏡下取40 倍圖片6～7 張，采用Image J 軟件測定每個生精小管的生精上皮厚度和生精小管直徑，計數200個以上者，取平均值。

2.3 睪丸支持細胞緊密連接超微結構觀察 取經4%多聚甲醛灌注固定的大鼠睪丸組織，切成薄片狀后置于2.5%戊二醛固定液中固定，PBS 漂洗3次，1%鋨酸固定液中固定2 h，PBS 漂洗3 次，組織梯度脫水（50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、無水乙醇15 min、無水乙醇＋丙酮溶液和丙酮溶液中各15 min），置于丙酮＋環(huán)氧樹脂包埋劑（1∶1）中，烘烤5 h 使丙酮揮發(fā)，再置于包埋盒中，放到60 ℃烘箱中使包埋劑充分固化，置于超薄切片機上進行超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鋁雙重染色后在電鏡下觀察支持細胞緊密連接超微結構變化。

2.4 睪丸支持細胞緊密連接蛋白表達檢測 稱取20～30 mg 大鼠睪丸組織，按RIPA 裂解液與PMSF 100∶1 的比例提取總蛋白，BCA 法對蛋白進行定量，在上清液中按4∶1 比例加入蛋白上樣緩沖液，置于沸水浴中加熱變性10 min，進行電泳和轉膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，超敏ECL 顯影液進行顯影，Image Pro Plus 軟件進行分析，以β?actin 為內參，計算各蛋白條帶與內參照的灰度比值。剔除病變組織編號樣本后，將每組剩余7～8個樣本進行檢測，重復3次，取平均值。

2.5 睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin、Claudin?11、p?p38MAPK 表達和定位檢測 取大鼠睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，高壓修復10 min，待冷卻完全后滴加5% BSA 封閉組織60～90 min，再滴加0.03% Triton X?100＋PBS 稀釋的一抗，4 ℃下孵育過夜，滴加相應二抗，室溫下孵育1 h，DAPI 染核10 min，滴加適量抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組樣本目的蛋白表達與定位，拍照取圖。剔除病變組織樣本后，每組取5個進行實驗，每個隨機取400 倍下10個視野，觀察大約200個睪丸支持細胞緊密連接相關蛋白的表達情況，通過Image Pro Plus 軟件進行相對熒光強度分析，重復3 次，取平均值。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過Graphpad Prism7.0、Image pro plus 6.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸組織形態(tài)的影響 如圖1 所示，青年對照組大鼠睪丸組織形態(tài)結構良好；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠生精小管間縫隙增大，生精細胞數量減少、排列紊亂；五子衍宗方組可改善衰老大鼠生精小管間隙，增加生精細胞數量。與青年對照組比較，衰老模型組大鼠睪丸生精上皮厚度和生精小管直徑下調（P＜0.01），五子衍宗方高劑量可上調兩者（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸組織形態(tài)的影響（， n＝7）Fig.1 Effects of Wuziyanzong Recipe on the morphologies of testicular tissues of aging rats（， n＝7）

3.2 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接超微結構的影響 如圖2 所示，青年對照組大鼠睪丸支持細胞緊密連接完整，邊界清晰；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細胞間緊密連接縫隙增大，連接松散，緊密連接斷裂，邊界不清晰；與衰老模型組比較，五子衍宗方組可縮小緊密連接間縫隙，減少緊密連接斷裂，保持緊密連接邊界清晰，進而改善衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接超微結構。

圖2 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接超微結構的影響Fig.2 Effects of Wuziyanzong Recipe on the ultrastructure of Sertoli cells tight junctions in aging rats

3.3 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 表達的影響 如圖3 所示，與青年對照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細胞ZO?1、Occludin 表達降低（P＜0.01），而五子衍宗方組可上調兩者表達（P＜0.01）。

圖3 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 表達的影響（， n＝3）Fig.3 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expressions of ZO?1 and Occludin in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.4 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1 表達和定位的影響 如圖4 所示，青年對照組大鼠睪丸組織中ZO?1 主要呈線狀分布于支持細胞周圍；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠ZO?1 表達降低（P＜0.01），僅在支持細胞周圍呈點狀分布，而五子衍宗方高劑量可上調其表達（P＜0.05）。

圖4 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1 表達和定位的影響（， n＝4）Fig.4 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of ZO?1 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.5 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白Occludin 表達和定位的影響 如圖5 所示，青年對照組大鼠睪丸組織中Occludin 呈線性表達于支持細胞之間和支持細胞與生精細胞間；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白Occludin 表達下調（P＜0.01），而五子衍宗方可上調其表達（P＜0.01）。

圖5 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白Occludin 表達和定位的影響（， n＝4）Fig.5 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Occludin in Sertoli cells in aging rats（，n＝4）

3.6 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達和定位的影響 如圖6 所示，青年對照組大鼠睪丸組織中Claudin?11 呈線狀分布于支持細胞周圍；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達下調（P＜0.01），而五子衍宗方高劑量可上調其表達（P＜0.05）。

圖6 五子衍宗方對衰老大鼠支持細胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達和定位的影響（， n＝4）Fig.6 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Claudin?11 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.7 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞p?p38MAPK 表達和定位的影響 如圖7 所示，青年對照組大鼠睪丸支持細胞核內p?p38MAPK 僅有少量表達；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠支持細胞p?p38MAPK 表達升高（P＜0.01），而五子衍宗方可降低其表達（P＜0.01）。

圖7 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸支持細胞p?p38MAPK 表達和定位的影響（， n＝3）Fig.7 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of p?p38MAPK in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.8 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸MMP?9 和Occludin 表達和共定位的影響如圖8 所示，MMP?9 定位于生精細胞與支持細胞間和生精細胞與生精細胞間；與青年對照組比較，衰老模型組大鼠MMP?9 表達增加，而且MMP?9 與Occludin 共定位增多；五子衍宗方組可下調其表達，降低兩者共定位表達。

圖8 五子衍宗方對衰老大鼠睪丸組織MMP?9 和Occludin 表達和共定位的影響Fig.8 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and co?localization of MMP?9 and Occludin in testicular tissue in aging rats

4 討論

隨著年齡的增長，睪丸組織在形態(tài)結構和功能上均會出現退行性變化，進而導致生精功能衰退［2］。研究發(fā)現，五子衍宗方可通過減輕生精小管萎縮和各級生精細胞脫落，改善睪丸組織形態(tài)結構，從而減輕醋酸棉酚對大鼠睪丸生殖功能的損傷［9］。本課題組前期研究發(fā)現，五子衍宗方可抑制生精細胞凋亡，從而改善衰老大鼠睪丸組織形態(tài)結構［10］。本研究發(fā)現，五子衍宗方可改善衰老大鼠睪丸組織的形態(tài)結構，顯著上調生精小管直徑和生精上皮的厚度。

血睪屏障是存在于睪丸支持細胞之間由連接復合體組成的特殊結構，為精子發(fā)生提供良好的生精微環(huán)境。已知緊密連接是血睪屏障的重要組成部分，主要由ZO 家族、Claudin 和Occludin 家族組成，在精子發(fā)生過程中精母細胞須穿過緊密連接進入近腔室，才能進一步分化為成熟的精子；若緊密連接功能被破壞，血睪屏障的通透性異常，精母細胞不能正常進入近腔室進行發(fā)育，進而導致生精功能障礙。我們前期研究顯示，隨著年齡的增長大鼠睪丸組織內Occludin 蛋白表達逐漸下調，血睪屏障被破壞，生精功能受損［11］；另有研究發(fā)現，當支持細胞Claudin?11 和Occludin 基因沉默后，支持細胞不能形成完整的緊密連接［3］。已知ZO?1 是緊密連接的主要銜接蛋白，與Occludin 和Claudin?11 定位于生精小管基底部，共同形成緊密連接。SOX9基因可在哺乳動物睪丸支持細胞中穩(wěn)定表達，可將其作為支持細胞的特異性標記物［12］。研究顯示，五子衍宗方可通過改善支持細胞骨架蛋白波形蛋白的表達，改善支持細胞功能，進而減輕雷公藤多苷對大鼠的生精功能損傷［13］；還可通過維持大鼠睪丸支持細胞緊密連接功能，減輕支持細胞凋亡，進而提高支持細胞熱應激的能力［14］。本研究發(fā)現，五子衍宗方可改善衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接超微結構，顯著上調衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 和Claudin?11 的表達。以上結果證實，五子衍宗方可通過改善衰老支持細胞緊密連接損傷，延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。

p38MAPK／MMP?9 通路與支持細胞緊密連接損傷相關［15］。研究顯示，脫敏煎通過下調 p?p38MAPK 蛋白表達，上調Occludin 蛋白表達，減輕TGF?β1 誘導的睪丸支持細胞緊密連接損傷［16］；黃芪甲苷可通過下調p?p38MAPK 蛋白表達，上調Occludin、ZO?1 和Claudin?11 的表達，維持支持細胞緊密連接的完整性，進而改善鎘所致大鼠睪丸生殖毒性［17］。加味五子 衍宗方可 通過抑制 p?p38MAPK 蛋白表達減輕β 淀粉樣蛋白誘導的海馬神經元損傷［18］。另有研究顯示，在脂多糖誘導腦血管內皮細胞損傷模型中，p38MAPK和MMP?9 mRNA 表達上調，Occludin和ZO?1 mRNA 表達下調，在加入MMP?9 抑制劑后，可上調Occludin表達［19］。本研究發(fā)現，五子衍宗方可下調衰老大鼠睪丸支持細胞p?p38MAPK 蛋白表達，下調睪丸組織MMP?9 蛋白表達，降低MMP?9 和Occludin 共定位的表達。這提示五子衍宗方可能通過抑制p38MAPK／MMP?9 通路活化，從而減輕睪丸支持細胞緊密連接損傷，延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。

綜上所述，五子衍宗方可通過抑制p38MAPK／MMP?9 通路的活化，減輕衰老大鼠睪丸支持細胞緊密連接損傷，進而延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。以期為五子衍宗方治療衰老睪丸生精功能衰退提供了新的研究思路。