TNF-α與系統(tǒng)性硬化病關系的研究進展①

陶志清 趙鋮（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，南寧530021）

系統(tǒng)性硬化?。╯ystemic sclerosis，SSc）是一種多系統(tǒng)結締組織疾病，其主要病理特征包括異常免疫激活、血管病變和組織纖維化，病因不明，較多認為是血管病變和免疫系統(tǒng)的活化與炎癥介質的產生導致不受控制的成纖維細胞活化［1］。SSc的典型表現(xiàn)是皮膚緊繃和雷諾現(xiàn)象，通常開始于四肢，尤其是手指和足趾的皮膚。根據皮膚受累程度，SSc可分為兩大類：局限性全身硬化（lcSSc）和彌漫性全身硬化（dcSSc）。在dcSSc中，纖維化遍及皮膚和內臟器官，而在lcSSc中，纖維化主要局限于手、手臂和面部。鑒于臨床癥狀和體征的異質性，美國風濕病學會/歐洲風濕病聯(lián)盟于2013年制定了新的分類標準［2］。SSc相關的肺間質疾病和肺動脈高壓的發(fā)展，是SSc中最常見的致殘和死亡原因［3］。TNF-α是一種多效細胞因子，參與誘導細胞凋亡、誘導炎癥、抑制病毒復制和纖維化過程中興奮性白細胞介素的信號傳導。TNF-α在感染的初始宿主反應和各種免疫介導的疾病發(fā)病機制中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在SSc患者血清中TNF-α水平升高，并有利于肺纖維化和肺動脈高壓的發(fā)展［4］。TNF-α通過調節(jié)纖維增生功能參與炎癥、纖維化、血管內皮的激活以及免疫反應的調節(jié)。因此，它被認為是SSc進展的主要因素。

1 系統(tǒng)性硬化病發(fā)病機制

1.1 遺傳相關因素流行病學研究表明，SSc患者的一級親屬患SSc的風險顯著增加：風險為1.6%，而在普通人群中，患SSc的風險為0.026%［5］。在這些集群中，親屬往往具有相同的疾病相關的自身抗體。這些數(shù)據表明SSc在親屬關系的人群中的遺傳易感性［5-6］。

1.2 內分泌相關因素有研究表明，內分泌可能參與了疾病狀態(tài)的啟動或傳播。女性性激素雌二醇增加了某些重要的SSc介質（干擾素-γ、白細胞介素-1和腫瘤壞死因子）的促纖維化作用［7］。

1.3 感染相關因素關于硬皮病感染觸發(fā)的一個假說是關于潛伏性巨細胞病毒（CMV）感染的作用，在SSc中發(fā)現(xiàn)的潛在致病的自體抗原與巨細胞病毒（CMV）上的UL94蛋白結合，也與人內皮細胞表面結合，從而引起內皮細胞凋亡（內皮細胞損傷通常被認為是SSc疾病過程中的早期事件）［8］。

1.4 腫瘤相關因素研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病和ARA抗體患者的惡性腫瘤發(fā)生率較高，且在這一亞群中，結締組織病的發(fā)生與癌癥的診斷有密切的時間關系［9-10］。JOSEPH等［11］從這一亞組患者提取的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶Ⅲ多肽A基因（POL3RA）的改變，但在來自相同患者的對照組織或來自其他硬皮病亞組患者的腫瘤組織中沒有發(fā)現(xiàn)。

1.5 免疫相關因素在細胞黏附分子活性增加的情況下，SSc中CD4陽性T細胞的遷移和活化增強［12］，這種細胞類型主要見于皮膚和肺組織的淋巴細胞浸潤［13-14］。輔助性T細胞17（Th17）亞群的分化可能是SSc的一個重要過程，這些細胞具有促纖維化作用［15］。

1.6 環(huán)境相關因素職業(yè)和工業(yè)接觸氯乙烯、二氧化硅粉塵和有機溶劑被認為是導致SSc的原因［16］。

2 TNF-α信號通路概述

2.1 TNF-α形成和家族TNF按其結構分為兩型：TNF-α和TNF-β，其中TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%~95%。TNF-α是一種多效細胞因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，也由淋巴細胞和NK細胞產生。TNF-α以可溶性和膜結合形式存在。可溶性血漿形式的TNF-α被金屬蛋白酶從膜形式上切割下來，該金屬蛋白酶稱為TNF-α轉化酶（TNF-α-converting enzyme，TACE），屬于ADAMs家族?？扇苄訲NF-α是分子量為17 kD的蛋白質，由157個氨基酸組成，形成受體激活的同源三聚體。目前已有19個TNF家族成員和29個受體被鑒定［17］。

2.2 TNF-α受體1和TNF-α受體2 TNF-α的活性是通過其兩種受體TNF-R1（p55）和TNF-R2（p75）介導的，它們的信號傳導活性不同。TNF-R1通常是促凋亡的，而TNF-R2通常是抗細胞凋亡的［18］。TNF-R1和TNF-R2具有相似的細胞外TNF結合結構，其特征在于四個重復的富含半胱氨酸的結構域，但具有不同的細胞內結構域［19］。TNF-R1和TNF-R2之間的主要結構差異導致其生物活性的差異，其主要原因在于TNF-R2缺乏細胞內死亡域。在許多系統(tǒng)中，TNF-α通過激活TNF-R1促進細胞凋亡，通過TNF-R2引起促存活信號傳導［20］。在結合TNF-α后，TNF-R1募集銜接蛋白TNF-R1相關死亡結構域蛋白（TRADD）及其下游半胱天冬酶（即胱天蛋白酶8），引起細胞凋亡［21］，相反，當TNF-α激活TNF-R2時，TNF受體相關因子（TRAF2）募集，從而刺激具有抗凋亡特性的核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB），與可溶性TNF-α相比，已知TNF-R2對膜結合TNF-α具有更高的親和力。TNF-R2的激活與Treg細胞的擴增和免疫抑制有關［20］。有研究推測TNFR2參與了纖維形成，TNFR2的過量表達，隨后蛋白酶脫落，與滅活的可溶性TNF相結合而產生抗炎作用。

3 TNF-α的生理功能

TNF-α具有多效性，TNF-α已被證實可調節(jié)多種炎癥和自身免疫過程。低水平的TNF-α可調節(jié)機體免疫反應起到抗感染的作用，高水平的TNF-α又會誘導其他炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等的分泌，促進體內炎癥反應［22-23］。TNF-α可通過促進T細胞增殖、損傷血管內皮細胞等作用殺傷腫瘤，也可通過募集免疫細胞、誘導產生前列腺素和環(huán)氧合酶、誘導氧化應激等途徑促進細胞變性與炎癥進展［24］。

4 TNF-α在系統(tǒng)性硬化病中的作用及異常表現(xiàn)

4.1 TNF-α促炎作用TNF-α是最重要的促炎細胞因子，它直接參與細胞凋亡，誘導其他細胞因子和炎癥介質的表達。TNF-α在SSc患者皮膚顆粒層的表達增加，特別是在SSc早期，提示TNF-α可能在SSc早期炎癥階段起作用，研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性硬化真皮成纖維細胞對TNF-α反應過度，細胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達在TNF-α刺激作用下增加到更大程度。TNF-α刺激活性氧（ROS）和活性氮物質（RNS）的釋放，消耗細胞谷胱甘肽，誘導炎癥細胞和上皮細胞增殖、細胞毒性和凋亡，并促進肺纖維化。TNF-α通過與受體相結合進而激活其下游的NFκB信號通路，促進了一系列的炎癥細胞因子IL-1、IL-6、IFN-γ等的分泌，放大了炎癥反應。TNF-α通過激活NF-κB信號通路促進肺間充質干細胞的肌成纖維細胞分化，這些結果表明，富含TNF-α的促炎微環(huán)境可能通過激活NF-κB信號傳導在間質炎癥和纖維化的發(fā)展中起重要作用［25］。

4.2 TNF-α促纖維化作用細胞因子在調節(jié)成纖維細胞功能（如增殖、遷移和基質合成）方面發(fā)揮重要作用，而這些介質的平衡可能在調節(jié)任何纖維化疾病、瘢痕形成和進展方面發(fā)揮著關鍵作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α可促進成纖維細胞增殖。TNF-α在膠原蛋白和膠原酶的轉錄調控中具有重要作用。它導致成纖維細胞增殖增加、膠原合成增加、膠原酶產量增加和蛋白酶產量增加等［26］。PIGUET等［27］發(fā)現(xiàn)皮內注射TNF-α刺激成纖維細胞和膠原蛋白的積累。HU等［28］發(fā)現(xiàn)TNF-α在體外促進成纖維細胞生長活性。

轉化生長因子β（TGF-β）是SSc纖維化病變的關鍵因子，參與細胞的生長、凋亡、分化以及細胞外基質的合成。TNF-α是一種具有纖維性質的細胞因子，能刺激膠原蛋白合成，誘導TGF-β并促進成纖維細胞的增殖［26］。TNF-α可加速上皮細胞向間充質細胞轉化（EMT）并上調原代小鼠肺成纖維細胞中TGF-β1的表達。TNF-α上調TGF-β1的表達，激活NF-κB，促進成纖維細胞的增殖、分化，最終導致肺纖維化［29］。

4.3 TNF-α促進血管內皮的激活TNF-α可能在SSc發(fā)病早期即血管改變中發(fā)揮重要作用。由于缺血再灌注是肺內皮損傷的主要決定因素，因此，TNF-α可能通過增強血小板活化因子誘導的肺循環(huán)血管收縮在SSc中發(fā)揮重要作用。TNF-α血清水平的升高可能促進內皮功能障礙，血管內皮生長因子（VEGF）是慢性免疫介導性和變應性疾病炎癥的重要介質，是一種改變微血管網絡的促血管生成因子，促進內皮功能障礙和肺動脈高壓的發(fā)生和進展［30-31］。此外，TNF-α增加了低密度脂蛋白受體1的基因表達，這種受體可以支持革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌對血管內皮細胞和巨噬細胞的黏附，表明其在炎癥和血管損傷中的作用。TNF-α還誘導血管黏附分子1（VCAM-1）的基因表達，VCAM-1在損傷和平滑肌細胞增殖的情況下，在單核細胞黏附和新內膜形成中起基本作用。TNF-α參與血管內皮的活化，通過調節(jié)成纖維細胞的功能來調節(jié)免疫反應和結締組織的代謝，在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機制中起重要作用［30］。

4.4 TNF-α免疫調節(jié)作用在SSc早期，T細胞產生干擾素和TNF-α。TNF-α是一種多效細胞因子，主要以其促炎特性而為人所知，然而TNF-α也具有免疫抑制反饋作用［32］。HUGLE等［33］首次采用多色流式細胞術研究了SSc患者真皮層不同白細胞亞群的TNFR的表達水平，結果表明TNFR1、TNFR2在彌漫性SSc患者真皮T淋巴細胞表達中上調，TNFR2的表達與皮膚增厚有關。用CD3/CD28抗體活化后，SSc患者外周血淋巴細胞較健康淋巴細胞產生更多的IL-6、可溶性IL-6受體（sIL-6R）和IL-13，TNFR1選擇性配體和可溶性TNF的共刺激進一步增加IL-6的表達，而TNFR2的刺激導致更高的sIL-6R的釋放。這說明膜結合TNF能有效激活TNFR1和TNFR2，對IL-6和sIL-6R表達有較強的影響，可能誘導IL-6信號傳導［33］。肺纖維化患者中相關IL-6和TNFR2的多態(tài)性報道支持膜結合TNF-α誘導的IL-6/sIL-6R相互作用觸發(fā)纖維化［34］?？扇苄訲NF主要通過TNFR1發(fā)出信號，是IL-6的強誘導劑。健康對照組和SSc患者在CD3/CD28刺激后，促纖維化細胞因子IL-13的產生差異較小，而TNF刺激后IL-13的產生增加。CD3/CD28與TNF共刺激SSc患者真皮T淋巴細胞上清液誘導成纖維細胞中1型膠原表達增高。因此，SSc組織中的T淋巴細胞過度表達TNFR2，而來自SSc患者的預先激活的外周血來源淋巴細胞是促纖維化的。通過兩種TNF-α受體，尤其是TNFR2共同刺激T細胞，進一步觸發(fā)膠原蛋白的生成［33］。TNF-α通過免疫調節(jié)參與纖維化機制如圖1所示。

圖1 TNF-α參與纖維化的作用機制Fig.1 Involvement mechanism of TNF-α in fibrosis

4.5 TNF-α在SSc中的表達PEHLIVAN等［35］證實了SSc患者血清中TNF-α水平升高，另一方面，SSc患者的TNF-α mRNA表達比正常對照組高2.66倍［36］。與其研究結果相同的是，還有其他研究顯示SSc患者的TNF-α mRNA表達和血清中TNF-α水平更高［35］。在美國SSc患者中進行的一項研究發(fā)現(xiàn)腎臟危象患者的血清TNF-α水平較高［37］。

4.6 TNF-α基因多態(tài)性與SSc易感性的關系在TNF-α基因（編碼TNF-α）的啟動子區(qū)，基因-308G>A（rs1800629）和-238G>A（rs361525）多態(tài)性與TNF-α的轉錄增加有關。一些關于TNF-α多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)不同人群中-308G>A和-238G>A多態(tài)性與SSc風險之間的關系。在墨西哥人口研究中評估了TNF-α-308G>A和-238G>A多態(tài)性與SSc易感性、TNF-α mRNA表達、TNF-α水平和SSc患者臨床變量之間的關系。根據共顯性遺傳模型，發(fā)現(xiàn)-308G>A多態(tài)性的遺傳基因型是SSc易感性的遺傳標記，而且與皮膚厚度和抗纖維蛋白原抗體水平有關，這些數(shù)據表明TNF-α通過自身抗體和纖維化的產生在SSc易感性中起著重要作用，但是沒有發(fā)現(xiàn)-238G>A多態(tài)性與疾病之間的關聯(lián)風險［36］。這些結果與土耳其人口研究的結果一致［38］；然而，這與日本人群研究結果不同，在日本人群中沒有發(fā)現(xiàn)這兩種TNFα多態(tài)性與SSc風險之間的關聯(lián)。一項在意大利進行的研究發(fā)現(xiàn)了-238G>A基因型多態(tài)性與SSc易感性，特別是與dSSc表型之間的關聯(lián)［39］。TNF-α基因多態(tài)性和SSc風險之間的這些異質性關聯(lián)可以通過每個被評估人群的遺傳結構來解釋，眾所周知，這是導致人群之間疾病發(fā)病率差異的原因。

5 TNF-α抑制劑在SSc中的治療作用

TNF-α抑制劑用于治療慢性免疫疾病或炎癥性疾病，其無論是作為單一藥物治療，還是與其他抗炎藥物或改善疾病的抗風濕藥物聯(lián)合治療，已經在大型隨機對照臨床試驗中證明有效。臨床上應用得較多的TNF-α抑制劑有：英夫利昔單抗、阿達木單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗和依那西普，這些藥物均可阻斷TNF-α的生物學作用；但他們在結構、藥代動力和作用機制上存在一定的差異。

TNF-α抑制劑在治療SSc中的潛在作用是由于這種慢性免疫介導的疾病中TNF-α的過度表達。PHUMETHUM等［40］發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗和依那西普可改善SSc患者的炎性關節(jié)炎和殘疾現(xiàn)象。PIGUET等［41］用英夫利昔單抗治療16例dcSSc，治療第26周時皮膚成纖維細胞的Ⅲ型膠原水平的血清氨基末端前肽和Ⅰ型膠原的分泌減少，表明新膠原形成減少，血清血管性血友病因子水平顯著下降。值得注意的是，血管性血友病因子水平升高與疾病嚴重程度增加有關。BOSELLO等［42］研究發(fā)現(xiàn)SSc和糜爛性多發(fā)性關節(jié)炎的患者對皮質類固醇或甲氨蝶呤治療沒有反應，而用依那西普治療卻可以減少關節(jié)腫脹和壓痛，延緩纖維化的進展，改善指尖潰瘍。LAM等［43］證實了依那西普治療SSc患者的療效和安全性。值得注意的是，用TNF-α抑制劑治療的患者發(fā)生全身性自身免疫性疾病的風險很低，目前沒有建議在抗TNF-α治療期間監(jiān)測自身抗體滴度。TNF-α抑制劑用于硬皮病肺纖維化和肺動脈高壓的基本原理是由于TNF-α水平的升高有利于肺間質和血管損傷。SZEKANECZ等［44］提示依那西普和阿達木單抗可能對脂質譜發(fā)揮有益作用，從而改善內皮功能障礙。依那西普可以降低血清TNF-α水平，增加內皮型一氧化氮合酶的組織表達和緩激肽的血管舒張反應。TNF-α抑制劑能夠降低VEGF、一氧化氮和誘導型一氧化氮合成酶的表達和產生［45］。英夫利昔單抗和依那西普可改善SSc中的炎性關節(jié)炎和殘疾。此外，TNF-α抑制劑通過降低PAH進展和急性心血管和/或腦血管事件的風險來改善內皮功能。綜上所述，TNF-α抑制劑可以改善SSc患者癥狀和延緩纖維化進展，然而，還需要對SSc患者進行TNF-α抑制劑隨機對照試驗，以確認TNF-α抑制劑在SSc相關關節(jié)炎治療中的潛在作用，并研究其在SSc患者的治療中對于皮膚和肺潛在的有益作用。SSc中使用TNF-α抑制劑的潛在有益作用和支持文獻見表1。

表1 SSc中使用的TNF-α抑制劑的潛在有益作用和支持參考文獻Tab.1 Potential beneficial effects and supporting refer?ences of each TNF-α inhibitor used in SSc

6 小結

SSc是一種復雜的自身免疫性疾病，其發(fā)病機理和治療方法仍需進行廣泛深入的研究。TNF-α通過調節(jié)纖維增生功能參與炎癥、纖維化、血管內皮的激活以及免疫炎癥反應的調節(jié)，與SSc的發(fā)病機制存在一定的相關性。并且，通過對相關研究進行總結表明TNF-α抑制劑可以改善SSc患者癥狀和延緩纖維化進展。為了提高SSc的治療水平，尚需對TNF-α抑制劑的治療作用進行進一步的研究。