脂多糖結合蛋白在胃癌組織中的表達及其意義的生物信息學分析①

任晨霞 武翠玲 韓鵬勇（長治醫(yī)學院中心實驗室，長治046000）

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計報告，胃癌是最常被診斷癌癥中的第5位，也是癌癥相關死亡的第3大因素，其5年總體生存率不到25%，是中國、日本和韓國等東亞國家最常見的癌癥［1-4］。盡管對胃癌發(fā)展方面的研究取得了一定進展，但對其治療方面的挑戰(zhàn)依然存在。手術輔助治療雖能提高約10%的治愈率，但仍有50%以上的局限性胃癌患者死于自身疾?。?］。進展期胃癌患者預后較差，5年生存率僅為20%～30%［6］。由于不良生活習慣的改變、疾病意識的提高和幽門螺桿菌的根除，胃癌發(fā)病率幾十年來雖然一直呈下降趨勢，但胃癌仍然是中國癌癥死亡的首要原因，發(fā)病率和死亡率分別為679.1/10萬和498.0/10萬［7-10］。胃癌的發(fā)生是一個連續(xù)的多階段生物過程，從慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生到異型增生和腺癌［11］。與胃癌風險增加相關的因素包括營養(yǎng)，如高鹽和硝酸鹽攝入、低維生素A、C飲食、大量煙熏或腌制食品攝入、冷藏食品的缺乏以及劣質飲用水［12］。其他風險因素包括暴露于橡膠和煤炭的職業(yè)、吸煙、幽門螺桿菌感染、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、輻射暴露及病人既往接受過治療良性潰瘍疾病胃手術等［13］。對胃癌發(fā)病的詳細分子機制的理解是改善這一復雜疾病的關鍵。近期多項研究表明炎癥基因的多態(tài)性與胃癌風險相關［14-16］。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一種存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁外的內毒素，可增強炎癥反應信號，并可能在炎癥性腸病、心血管疾病和癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮作用［17-19］。脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）是一種急性時相反應物，與LPS結合形成LPS-LBP復合物［20］。LBP在健康人血清中的濃度為5～10μg/ml，在革蘭氏陽性菌血癥中濃度升高［21-22］。LPS-LBP復合物可與分化抗原簇基因（cluster of differentiation 14，CD14）結合，CD14是一種糖基磷脂酰肌醇膜錨定糖蛋 白，其通過Toll樣 受體4（toll like receptor 4，TLR4）促進LPS信號在細胞內的轉導［20］。在LPS存在的情況下，LBP和CD14間發(fā)生短暫的相互作用，持續(xù)時間僅為數(shù)百ms，CD14在接受一個LPS分子后會迅速從LBP-LPS復合物中分離。LBP繼續(xù)與LPS結合并吸收另一個CD14。同時，CD14以TLR4依賴的方式向骨髓分化因子2（myeloid differentiation factor 2，MD2）傳遞單個LPS分子。TLR4-MD2復合物傳遞信號導致細胞因子和其他促炎介質的轉錄［23］。此外，LBP還可通過直接與外膜中的LPS結合來增強革蘭氏陰性病原體的吞噬能力［20］。LPS在宿主-病原體與天然免疫系統(tǒng)的相互作用中起關鍵作用。大部分LPS來自腸道微生物區(qū)系，由于腸屏障通透性增加而進入血液循環(huán)。部分LPS也會穿過胃黏膜進入血液循環(huán)，特別是對胃部病變的患者。在胃黏膜，LPS可通過干擾先天免疫細胞和獲得性免疫細胞的活性，減少炎癥反應，影響適應性T淋巴細胞反應，抑制幽門螺桿菌的清除，從而促進慢性胃炎的發(fā)展［24］。在原內毒素相關蛋白陽性（cytotoxin-associated protein gene A，CagA）的幽門螺桿菌感染患者的胃中，革蘭氏陰性分類群的比例明顯更高［25］。手術中LPS進入腹腔或體循環(huán)與手術創(chuàng)傷后轉移瘤的生長增強有關。在體外和體內的實驗研究中，LPS誘導的信號通路的激活促進癌細胞存活和增殖并減少轉移瘤細胞凋亡［26-29］。因此，LBP作為LPS暴露的標志，其對腫瘤細胞侵襲和轉移的影響尚不明確，LBP在胃癌組織中的表達與作用值得進一步研究。本研究分析了LBP在胃癌中的表達及LBP與預后的關系，并利用生物信息學方法分析LBP在胃癌中可能的信號調節(jié)網(wǎng)絡。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從Ualcan數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）獲取34例正常胃組織及415例胃癌組織的LBP表達數(shù)據(jù)。胃癌組織中Ⅰ期168例，Ⅱ期84例，Ⅲ期82例，Ⅳ期6例；男245例，女117例；21～40歲27例，41～60歲140例，61～80歲181例，81～100歲10例。部分患者無法準確分期或缺性別信息，以及＜20歲和＞100歲的患者例數(shù)過少均未納入統(tǒng)計。LBP表達數(shù)據(jù)來自Ualcan的轉錄組測序（RNA-Seq），基因表達量的衡量指標為TPM法（transcript per million）。

1.2 方法 分析胃癌組織與正常組織及胃癌患者不同分期、性別、年齡不同分組間LBP的表達差異，并于LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http：//www.linkedomicsorg）［30］中檢索LBP共表達基因，得出與LBP正相關及負相關表達基因的熱圖，同時對共表達基因做GO富集分析、KEGG通路分析。基于GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（http：//gepia.cancer-pku.cn）［31］分析LBP與胃癌患者總體生存率（overall survival，OS）與無病生存時間（disease-free survival，DFS）的關系，繪制LBP表達水平與預后生存曲線。最后通過STRING（https：//string-db.org）［32］進行相關基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡分析，基于Cytoscape進行網(wǎng)絡可視化，并通過其中內嵌的cytoHubba［33］軟件進行排前10位的關鍵基因分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 LBP表達量經(jīng)四分位數(shù)分成4等份，并分別繪制成箱線圖進行比較，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（4分位間距）［M（P25，P75）］表示，采用秩和檢驗。GEPIA數(shù)據(jù)庫使用Kaplan-Meier生存分析法計算生存時間及生存率，并繪制OS及DFS曲線，采用Log-rank檢驗比較不同表達水平的生存差異從而得出P值。

2 結果

2.1 LBP在胃癌與正常胃組織中表達情況 Ualcan數(shù)據(jù)庫中34例正常胃組織LBP表達水平為0.014（0.029，0）；415例胃癌組織中LBP表達水平為0.051（0.138，0.01）。胃癌組織中LBP表達水平明顯高于正常胃組織（P＜0.01，圖1A）。

2.2 LBP在胃癌不同分期中表達情況 Ualcan數(shù)據(jù)庫中18例Ⅰ期胃癌組織中LBP表達水平為0.039（0.257，0.01）；123例Ⅱ期胃癌組織中LBP表達水平為0.05（0.158，0.01）；169例Ⅲ期胃癌組織中LBP表達水平為0.051（0.136，0.014）；41例Ⅳ期胃癌組織中LBP表達水平為0.067（0.214，0.022）。Ⅰ期和Ⅲ期胃癌組織中LBP表達水平均明顯高于正常胃組織（P＜0.05），而Ⅱ期和Ⅳ期胃癌組織中LBP表達水平與正常胃組織差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各期胃癌組織組中LBP表達水平兩兩比較結果顯示，Ⅲ期胃癌組織LBP表達水平高于Ⅰ期胃癌組織（P＜0.05），其余各分期間LBP表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1B）。此外，幽門螺桿菌陽性胃癌組織中LBP的表達水平為0.073（0.11，0.017），與正常組織差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 LBP在胃癌不同性別分組中表達情況 Ualcan數(shù)據(jù)庫中268例男性胃癌患者胃癌組織中LBP表達水平為0.055（0.148，0.015）；147例女性患者胃癌組織中LBP表達水平為0.045（0.122，0）。與正常人相比，男性胃癌患者胃癌組織中LBP表達水平顯著升高（P＜0.01，圖1C）。

2.4 LBP在胃癌不同年齡分組中表達情況 Ualcan數(shù)據(jù)庫中4例21～40歲患者胃癌組織中LBP表達水平為0.259（0.523，0.043）；128例41～60歲患者胃癌組織中LBP表達水平為0.051（0.139，0）；253例61～80歲患者胃癌組織中LBP表達水平為0.048（0.123，0.01）；25例81～100歲患者胃癌組織中LBP表達水平為0.054（0.207，0.013）。61～80歲年齡段患者胃癌組織LBP表達水平明顯高于正常胃組織（P＜0.01，圖1D）。

圖1 LBP在胃癌腫瘤組織中的表達Fig.1 LBPexpression levels in gasric cancer tissue

2.5 LBP共表達基因熱圖 檢索LinkedOmics中與LBP相關的共表達基因，根據(jù)與LBP表達的相關性繪制出共表達基因熱圖，圖2A為前50個與LBP呈顯著正相關關系的基因集，圖2B為前50個與LBP呈顯著負相關關系的基因集。這一結果表明LBP對轉錄組有廣泛影響。

圖2 共表達基因熱圖Fig.2 Heat maps of co-expressed genes

2.6 LBP共表達基因GO富集分析 于LinkedOmics中檢索到3 061個與LBP共表達的基因，對相關系數(shù)＞0.3的共表達基因進行GO富集分析，結果發(fā)現(xiàn)，這些共表達基因主要集中于急性炎癥反應、激活蛋白級聯(lián)、蛋白質-脂質復合物亞基組織、蛋白質復合體的重構、血漿脂蛋白顆粒水平的調節(jié)、血小板脫粒、細胞溶解、脂蛋白本地化、體液免疫反應、脂質穩(wěn)態(tài)、排泄、維生素運輸、調節(jié)脂肪酶的活性、細胞因子的分泌等生物學過程（表1）；位于血液微粒、蛋白質-脂質復合物、內質網(wǎng)腔、血小板α顆粒、細胞外基質、囊腔、空泡腔、脂滴、血小板致密顆粒、初級溶酶體等細胞成分（表2）；參與貨物受體活性、脂多糖結合、蛋白質-脂質復合物的綁定、糖胺聚糖綁定、氧氣結合、軸突導向因子受體結合、碳水化合物跨膜轉運蛋白活性、細胞外基質結構成分、絲氨酸水解酶活性、肽受體的活動等分子功能（表3，均P＜0.05）。因此，LBP共表達基因主要為位于細胞外基質、內質網(wǎng)腔等不同細胞亞結構內的蛋白質-脂質復合物成分，參與多種貨物受體綁定與結合、炎癥反應、激活蛋白級聯(lián)反應等功能。

表1 生物學過程Tab.1 Biological process

表2 細胞成分Tab.2 Cellular component

表3 分子功能Tab.3 Molecular function

2.7 KEGG通路分析 KEGG通路分析結果顯示，這些共表達基因明顯富集于補體和凝血級聯(lián)、膽固醇代謝、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs）信號通路、金黃色葡萄球菌感染、瘧疾、硫胺素新陳代謝、黏多糖生物合成、維生素的消化和吸收、朊病毒疾病、皮質醇的合成和分泌和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等信號通路（均P＜0.05，表4）。當胃癌中與LBP表達變化時，與其共表達的基因參與的上述信號通路的活性也會相應改變，這些信號通路可能與胃癌發(fā)生發(fā)展過程中LBP的高表達及不良預后密切相關。

表4 通路分析Tab.4 Pathway analysis

2.8 LBP表達與胃癌預后的關系 圖3為利用GEPIA數(shù)據(jù)庫繪制出的LBP表達水平與胃癌患者預后生存曲線圖，分析了LBP表達水平與OS、DFS間的關系。結果顯示，LBP高表達患者OS、DFS均明顯低于LBP低表達患者（P=0.013、P=0.044）。

圖3 不同LBP表達情況患者生存曲線Fig.3 Survival curves of patients with different LBP expression profiles

2.9 LBP蛋白相互作用網(wǎng)絡分析 STRING數(shù)據(jù)庫檢索結果顯示，LBP與多個蛋白具有相互作用關系（圖4）。以Cytoscape篩選網(wǎng)絡中關鍵基因，發(fā)現(xiàn)

圖4 LBP蛋白相互作用網(wǎng)絡圖及網(wǎng)絡中的關鍵基因Fig.4 Protein-protein interaction（PPI）network of LBP and its hub genes

TLR4、STAT3、IL-6、STAT6、IL-4、IL-10、JAK1、JAK2、JAK3、SOCS3為網(wǎng)絡中排名前10位的關鍵節(jié)點（表5），表1顯示這10個節(jié)點的“degree”值，每個節(jié)點的“degree”值是指與此節(jié)點相互作用的節(jié)點個數(shù)，其大小與該節(jié)點的核心度成正比，即依賴此節(jié)點的通路越多，其核心度越大。

表5 相互作用網(wǎng)絡中排前10位的關鍵基因Tab.5 Top 10 hub genes of PPI network

3 討論

目前，臨床上胃癌的治療主要依賴于手術、化療、免疫治療和靶向治療，但隨著腫瘤相關耐藥性的不斷提高，治療效果明顯降低，尋找新的胃癌分子標志物和治療靶點并實現(xiàn)胃癌的精準醫(yī)療，依舊是一個亟待解決的問題。本研究發(fā)現(xiàn)LBP在胃癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，特別是在Ⅰ期和Ⅲ期胃癌、61～80歲和男性患者中表達升高。幽門螺桿菌是胃癌發(fā)生最重要的影響因素之一，屬于革蘭氏陰性菌，含有LPS毒力因子。LBP屬于管狀脂結合蛋白家族，與LPS形成高親和力復合物后，和單核細胞表面的CD14蛋白結合，啟動炎癥介質的釋放［34-35］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)LBP的表達與幽門螺桿菌感染無顯著相關性。這與FREDRIK等［36］的研究結果一致。胃部對幽門螺桿菌感染的免疫應答與白介素有關，但不依賴于LBP-TLR4信號通路。這可能是由于幽門螺桿菌的O-特異性鏈具有與人類Lewis血型抗原結構相似的分子擬態(tài)作用［24］，可降低宿主免疫應答機制，包括吞噬、自然殺傷細胞活性和T淋巴細胞增殖，促使幽門螺桿菌能夠持續(xù)存在，且LBP不能發(fā)揮作用［25］。

胃癌組織中與LBP存在共表達關系的基因功能除了涉及脂多糖結合、急性炎癥反應、蛋白質-脂質復合物亞基組織等這些已知的LBP相關功能外，還包括激活補體和凝血級聯(lián)、膽固醇代謝、PPAR信號等。補體和凝血級聯(lián)反應普遍存在于多細胞生物中，對于維持凝血-纖溶系統(tǒng)平衡和激活先天性免疫具有重要作用，最新研究表明，該信號通路的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［37-38］。血清膽固醇水平的升高與許多惡性腫瘤顯著相關，代謝綜合征及其組分在分化差的晚期胃癌患者中升高，提示其可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［39-40］。PPARs是核激素受體超家族成員，與視黃素X受體在細胞核中形成異源二聚體，并與靶基因的PPAR反應元件結合，產(chǎn)生廣泛的生理功能。隨著對其生理作用的進一步了解，PPARs及其激動劑近年來在癌癥研究中得到了廣泛關注。由胃食管反流引起的NF-κB慢性激活和cox-2及胃泌激素表達增加，可能是慢性炎癥相關的癌癥促進因素，PPARγ的激動劑2-花生四烯酰甘油可降低NF-κB和cox-2活性［41-43］。非諾貝特通過抑制PPAR通路誘導線粒體重編程，改變胃癌細胞的糖脂代謝，抑制胃癌細胞的增殖，促進胃癌細胞的凋亡［8］。此外，LBP相關的維生素與氨基酸等代謝相關通路也會影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，提示LBP可通過上述信號通路作為胃癌的治療靶點和預后指標。

LBP通過相互作用網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點發(fā)揮其生物學功能。網(wǎng)絡中的10個關鍵基因中的TLR4、IL-6、IL-4和IL-10分子可能與LBP共同協(xié)作參與胃癌組織的免疫調節(jié)功能。然而，文獻報道TLR4不參與胃部幽門螺桿菌感染的免疫應答，TLR4和MD-2參與胃癌細胞的增殖和侵襲，特別是高水平的TLR4與更高的胃癌風險有關［44］。臨床數(shù)據(jù)顯示，IL-6在胃癌組織中的上調與化療不良反應相關，是化療耐藥性的關鍵因素［45］。IL-4參與胃腸道器官炎癥介導的癌變過程［46］。IL-10在胃癌患者的胃癌組織和血清樣本中表達顯著上調，通過激活c-Met/STAT3信號通路顯著增加胃癌的細胞增殖和遷移能力［47］。JAK激酶是轉錄信號通路的信號轉導者和激活因子，與腫瘤的發(fā)生密切相關。STAT3是許多致癌細胞過程的強有力的驅動力，參與腫瘤細胞增殖、生存和遷移、炎癥、血管生成和免疫抑制等過程，與STAT6均可增強胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。JAK2/START3通路的持續(xù)激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化。SOCS是細胞因子信號的抑制因子，可負向調節(jié)JAK/STAT系統(tǒng)信號轉導［48］。上調SOCS3表達可抑制JAK-STAT3信號通路，抑制胃癌細胞增殖，阻滯細胞周期，并促進細胞凋亡。下調SOCS表達可激活JAK2/STAT3信號通路誘導胃癌的阿帕替尼耐藥［49］。LBP是否通過上述信號通路調控胃癌的發(fā)生發(fā)展以及LBP在臨床治療中的潛在應用價值，值得進一步實驗研究。