柚皮素調(diào)控NLRP3炎性小體對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎新生小鼠腸道的保護(hù)作用研究

田洪民 王淑屏 王鴻雁 盧憲梅（濟(jì)南市第三人民醫(yī)院小兒科，濟(jì)南250132）

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一種多因素引起的嚴(yán)重威脅新生兒健康的消化系統(tǒng)疾病，能引起嚴(yán)重的腸道炎癥，其相關(guān)死亡率一直較高（20%～30%）［1］。NLRP3炎性小體（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3）作為一種蛋白復(fù)合物，由上游NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn) 樣 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）以及下游半胱天冬酶-1（Caspase-1）組成。適度激活NLRP3能引起機(jī)體固有免疫反應(yīng)，但過度激活將引發(fā)一系列炎癥性疾?。?］。研究表明，NLRP3參與NEC發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)，因此有效抑制NLRP3炎性小體的活化或許可以為治療NEC新藥的研發(fā)提供思路［3］。柚皮素（naringenin，NAR）是一種具有抗炎抗氧化以及抗菌作用的黃酮類化合物，廣泛存在于柚、葡萄柚和酸橙中，具有預(yù)防心血管疾病、癌癥等多種疾病的生理活性［4］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能通過抑制NLRP3炎性小體激活保護(hù)重癥急性胰腺炎相關(guān)的心肌損傷，但柚皮素是否能通過抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善NEC腸道炎癥損傷目前尚不明確［5］。因此，本研究擬探討柚皮素對(duì)NEC腸道炎癥損傷的作用及其對(duì)腸道組織NLRP3炎性小體活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）和脂多糖均購自美國Sigma公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega生物公司；抗體兔抗NLRP3、ASC、Caspase-1和GAPDH均購自英國Abcam公司；?，擜R-8100氧氣濃度檢測(cè)儀購自深圳富蘭克電子有限公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；切片機(jī)購自德國萊卡公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熱循環(huán)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（SPF）級(jí)C57BL/6雄鼠和雌鼠均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（粵）2018-002。飼養(yǎng)溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照周期12 h/12 h，自由進(jìn)食和飲水。每周更換一次飼育籠，交配比例雌雄2∶1。

1.2 方法

1.2.1 NEC模型建立及分組 雌鼠自然受孕分娩后，將68只出生3 d的新生小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（Control），模型組（NEC），柚皮素低劑量組（L-NAR）和柚皮素高劑量組（H-NAR），每組17只。所有小鼠均母鼠母乳喂養(yǎng)，正常對(duì)照組小鼠僅給予等量生理鹽水腹腔注射，其他組均采用缺氧冷刺激+LPS腹腔注射法［6］建立NEC模型。柚皮素低、高劑量組小鼠分別予以腹腔注射5 mg/kg、20 mg/kg NAR，1次/d，持續(xù)3 d。第5天脫頸致死，取NEC癥狀最常發(fā)生的回腸遠(yuǎn)端和結(jié)腸近端的回盲部腸組織進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 小鼠大體觀察、臨床癥狀積分以及體重變化 記錄新生小鼠的實(shí)驗(yàn)前后的體重，并每天觀察各組小鼠一般情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，一般情況包括：進(jìn)食、精神活動(dòng)狀態(tài)、大便性狀、有無腹瀉、刺激反應(yīng)等。臨床癥狀積分從3方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：①精神活動(dòng)狀態(tài)：不間斷活動(dòng)為正常（0分），明顯活動(dòng)減少（1分），在一定刺激下被動(dòng)活動(dòng)（2分），對(duì)被動(dòng)活動(dòng)不敏感（3分）。②大便性狀：球形黑便為正常（0分），水分增加成軟便（1分），不成形稀糊狀便（2分），水樣便（3分）。③便血情況：糞便潛血檢測(cè)陰性（0分），糞便潛血檢測(cè)陽性（1分），糞便上明顯附著血跡且肛門無血跡（2分），血便且肛門口現(xiàn)大量血跡（3分）。

1.2.3 HE染色觀察回盲部腸組織病理學(xué)變化并評(píng)分 取小鼠回盲部腸組織，固定于4%多聚甲醛中24 h，采用濃度梯度乙醇脫水，透明后石蠟包埋，切片機(jī)切片，厚度5μm，經(jīng)蘇木精、伊紅染色后，脫水封片，在顯微鏡下觀察各組小鼠腸組織病理學(xué)變化。參照改良的Nadler標(biāo)準(zhǔn)［7］行雙盲法評(píng)分，病理評(píng)分≥3分視為NEC。

1.2.4 ELISA檢測(cè)小鼠回盲部腸組織中IL-6、TNFα、IL-1β和IL-18含量 制備各組小鼠回盲部腸組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腸組織勻漿中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè) 用TRIzol試劑從各組小鼠回盲部腸組織中提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再根據(jù)熒光定量PCR試劑盒，配制上樣混合物，以cDNA為模板，利用熒光定量PCR儀檢測(cè)分析NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，接著95℃15 s，58℃40 s，72℃40 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的mRNA表達(dá)水平。引物序列：NLRP3上游5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游5′-GCTTCAGTCCCACACACAGA-3′；ASC上游5′-GTGTTTACTCTCTGGGATGTTTTTG-3′，下游5′-GTCTGTGGAATTTAGGTGTTGGA-3′；Caspase-1上游5′-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3′，下游5′-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3′；β-actin上游5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3′，下游5′-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3′。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 將RIPA緩沖液加入剪碎的小鼠回盲部腸組織中，在勻漿器中研磨20 min后，12 000 r/min離心20 min，取上清液即為組織裂解液。再用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白煮沸5 min后上樣，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，TBST洗滌3次，加入一抗NLRP3（1∶200）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶500）和β-actin（1∶1 000），然后將含一抗的膜置于4℃中孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h。利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯影曝光后，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，多組中的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)分析。P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠大體觀察、臨床癥狀積分以及造模前后體重比較 如表1所示，實(shí)驗(yàn)前，4組小鼠一般情況和體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)后，Control組小鼠進(jìn)食以及排便正常，精神狀態(tài)良好，體重（2.52±0.15）g，且全部存活，臨床癥狀積分（0.36±0.11）分；NEC組小鼠在NEC造模24 h后逐漸出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳，活動(dòng)度降低，反應(yīng)遲鈍，腹脹腹瀉，血便等情況，且逐漸加重，造模64 h后出現(xiàn)5只小鼠死亡，而NEC組小鼠實(shí)驗(yàn)后體重（1.88±0.12）g，臨床癥狀積分為（7.71±1.18）分，較Control組體重明顯降低（P＜0.05），臨床癥狀積分明顯升高（P＜0.05）。L-NAR組小鼠在NEC造模30 h后逐漸開始出現(xiàn)NEC情況，沒有明顯改善，造模65 h后出現(xiàn)4只小鼠死亡，且實(shí)驗(yàn)后體重為（1.96±0.11）g，臨床癥狀積分為（6.94±1.32）分，較NEC組體重和臨床癥狀積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而H-NAR組小鼠在NEC造模45 h后也逐漸出現(xiàn)活動(dòng)度降低，腹瀉腹脹，排黃綠色黏便，但程度較NEC組輕，實(shí)驗(yàn)后體重為（2.28±0.18）g，臨床癥狀積分為（4.53±1.07）分，較NEC組的明顯升高（P＜0.05），臨床癥狀積分明顯降低（P＜0.05），且僅在造模70 h后出現(xiàn)1只死亡。

表1 比較各組小鼠造模前后體重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

表1 比較各組小鼠造模前后體重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NEC group，2）P＜0.05；compared with beforemodeling，3）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 Before modeling 1.79±0.10 1.81±0.12 1.78±0.10 1.80±0.11 After modeling 2.52±0.153）1.88±0.121）1.96±0.113）2.28±0.182）3）

2.2 NAR對(duì)小鼠腸組織病理變化以及評(píng)分的影響 如圖1所示，Control組可見完整清晰的回盲部腸組織結(jié)構(gòu)，腸絨毛高聳，腸上皮排列整齊，黏膜層、黏膜下層及固有層均未斷裂或腫脹分離；NEC組和H-NAR組可見腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛結(jié)構(gòu)雜亂、脫落甚至消失、肌層變薄甚至斷裂；H-NAR組腸組織結(jié)構(gòu)較清晰，絨毛存在部分脫落或斷裂，整體較NEC組改善明顯；如圖2所示，與Control組比較，NEC組病理評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與NEC組比較，H-NAR組病理評(píng)分明顯降低（P＜0.05），而LNAR組病理評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 HE染色觀察小鼠回盲部結(jié)腸組織病理變化（×400）Fig.1 HE staining was used to observe pathological changes of ileocecal colon in mice（×400）

圖2 比較小鼠回盲部結(jié)腸組織病理評(píng)分Fig.2 Comparison of histopathological scores of ileocecal colon in mice

2.3 NAR對(duì)小鼠腸組織勻漿中炎癥因子水平的影響 如表2所示，與Control組比較，NEC組小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與NEC組比較，H-NAR組小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而L-NAR組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

表2 各組小鼠腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NECgroup，2）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 TNF-α 17.62±5.79 66.38±15.111）57.45±13.85 31.42±11.362）IL-6 46.53±17.55 167.31±32.301）144.25±31.40 81.54±22.352）IL-1β 97.55±25.86 352.61±59.701）304.22±67.52 188.52±34.662）IL-18 57.56±25.49 256.77±42.451）222.85±50.56 122.24±38.812）

2.4 NAR對(duì)小鼠腸組織NLRP3炎性小體表達(dá)的影響 如圖3所示，與Control組比較，NEC組小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與NEC組比較，HNAR組小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），而L-NAR組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠腸組織NLRP3炎性小體表達(dá)檢測(cè)Fig.3 Expression of NLRP3 in intestinal tissue of mice in each group

3 討論

多年來，NEC的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是由早產(chǎn)、腸內(nèi)喂養(yǎng)、腸缺血和細(xì)菌效應(yīng)等幾個(gè)關(guān)鍵危險(xiǎn)因素引起的。此外，在20世紀(jì)60年代和70年代有人提出，這些危險(xiǎn)因素能刺激腸道或NEC并發(fā)其他部位的炎癥反應(yīng)［8］。研究報(bào)道稱，細(xì)菌產(chǎn)物如內(nèi)毒素（也稱脂多糖）與NEC有關(guān)，這些細(xì)胞膜配體引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸壞死［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生NEC小鼠的回盲部腸組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)損傷，并且腸組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯升高，其中促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的含量升高可能是由于NLRP3炎性小體活化并介導(dǎo)Caspase-1表達(dá)所致［10］。有研究表明，NLRP3炎性小體能激活Caspase-1，介導(dǎo)炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，可進(jìn)一步募集和激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)局部和全身炎癥反應(yīng)［11］。而NLRP3炎性小體的過度活化引起的炎性損傷廣泛參與2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［12-14］。本研究結(jié)果表明，在新生NEC小鼠的腸組織中NLRP3炎性小體活化也異常增高，提示抑制NLRP3炎性小體活化或許能改善NEC小鼠腸道損傷。

眾所周知，自然界中廣泛存在的天然藥物已成為研發(fā)新型藥物的重要來源。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些天然藥物能夠通過抑制NLRP3炎性小體活化而發(fā)揮作用，比如梔子苷通過抑制壞死病介導(dǎo)的NLRP3炎性小體信號(hào)傳導(dǎo)，改善了d-半乳糖胺和LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷［15］；竹節(jié)參皂苷Ⅳa通過阻斷NLRP3/Caspase-1通路對(duì)七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥具有神經(jīng)保護(hù)作用［16］；丹參酚酸A能抑制主動(dòng)脈組織NLRP3炎性小體活性，減輕2型糖尿病并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體內(nèi)慢性炎癥引起的損傷［17］。柚皮素，又稱4′，5，7-三羥黃酮，是一種柑橘黃烷酮，是現(xiàn)代社會(huì)消耗量最大的類黃酮之一，具有良好的生物利用和醫(yī)療應(yīng)用。已有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能夠通過抑制NLRP3炎性小體活化改善重癥急性胰腺炎誘導(dǎo)的心肌損傷［5］。本研究結(jié)果顯示，柚皮素能夠下調(diào)NEC小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明柚皮素也能夠抑制NEC小鼠腸組織中NLRP3炎性小體活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素還能夠降低NEC小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18等炎癥因子表達(dá)水平，并且對(duì)NEC新生小鼠腸組織損傷具有保護(hù)作用，表明柚皮素可能通過抑制NLRP3炎性小體表達(dá)，降低腸組織炎癥水平，緩解NEC新生小鼠腸組織炎癥損傷。

綜上所述，柚皮素通過抑制NLRP3炎性小體表達(dá)，降低新生NEC小鼠腸組織炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮NEC腸道保護(hù)作用，為NEC的預(yù)防和治療提供了新思路。但本研究?jī)H從動(dòng)物水平探討柚皮素對(duì)NEC的影響，并且無藥物陽性組，無法評(píng)估柚皮素對(duì)NEC的影響程度。后期將進(jìn)一步完善研究的局限性，并深入探討柚皮素調(diào)控NLRP3炎性小體表達(dá)的可能分子機(jī)制。