人參皂苷Rh4調(diào)控ERK和AKT信號通路對T-ALL細(xì)胞凋亡的影響

王雪蓮 孟亞紅 孫麗華（上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海201700）

T急性淋巴細(xì)胞白血病（T-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種侵襲性血液腫瘤，約占所有淋巴細(xì)胞白血病的20%，成人發(fā)病率顯著高于兒童［1］。PI3K/AKT及ERK通路上調(diào)是T-ALL發(fā)生發(fā)展的重要通路，抑制其上調(diào)可治療T-ALL［2-3］。人參作為傳統(tǒng)中草藥已被廣泛使用2 000余年，具有抗過敏、抗氧化、免疫刺激等特性，可調(diào)節(jié)血壓、代謝和免疫功能，人參皂苷Rh4是人參三醇的主要活性單體，僅結(jié)合1個糖基，具有低極性、易被腸道吸收的特點(diǎn)，可通過調(diào)節(jié)ROS/JNK/p53通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［4］。Rh4還可誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞分化并抑制其增殖，但對T-ALL的作用和機(jī)制尚未闡明［5］。本研究主要探討人參皂苷Rh4通過調(diào)控ERK和AKT信號通路對T-ALL細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人T-ALL細(xì)胞系Molt4（CRL-1582，美國ATCC公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（C11875500BT，美國Gibco公司）；人參皂苷Rh4（PHL85741，美國Sigma公司）；PI3K抑制劑LY294002（S1105）和MEK抑制劑U0126（S1102，Selleck公司）；CCK-8試劑盒（B20185364，碧云天公司）；Annexin V-FITC/碘化丙錠（PI）試劑盒（2170822）、FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（加拿大BDBiosciences公司）；Model 680酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和處理 Molt4細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，加入終濃度為0、10、20、40、60、80和100μmol/L的Rh4培養(yǎng)24、48和72 h，CCK-8法計算抑制率=（OD實驗-OD對照）/OD對照×100%。為研究Rh4通過PI3K/AKT通路對T-ALL的作用，將細(xì)胞分為對照組、Rh4組、Rh4+LY294002組和LY294002組，Rh4濃度為42.75μmol/L，LY294002濃度為50μmol/L［5-6］。為分析Rh4通過MEK/ERK通路對T-ALL的作用，將細(xì)胞分為對照組、Rh4組Rh4+U0126組和U0126組，Rh4濃度為40μmol/L，U0126濃度為50μmol/L［7］。對照組加入等體積溶劑培養(yǎng)48 h。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況 將1×105個處理后細(xì)胞（150μl）接種于96孔板，分別在第24 h、48 h和72 h加入10μl CCK-8試劑，37℃孵育顯色，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 處理后的細(xì)胞采用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，將1×106個細(xì)胞先后采用預(yù)冷PBS和5%牛血清白蛋白（BSA）洗滌3次，2 000 r/min離心，加入300μl 5%BSA和700μl 70%預(yù)冷酒精，低溫孵育過夜，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入100μl結(jié)合緩沖液和5μl Annexin-V-FITC（20μg/ml）靜置15 min，黑暗中孵化，加入150μl結(jié)合緩沖液和10μl PI（50μg/ml）靜置15 min，黑暗中孵化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 將細(xì)胞研磨、裂解并收集總蛋白，分別取等量總蛋白在120 V下SDS-PAGE電泳分離90 min，50 V、120 min下轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入anti-p-AKT、anti-AKT、anti-p-ERK1/2和anti-ERK1/2（1∶500）4℃孵育過夜，加入HRP偶聯(lián)二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL曝光，以GAPDH為內(nèi)參，Image PD軟件定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh4對Molt4細(xì)胞的抑制作用 人參皂苷Rh4終濃度為0、10、20、40、60、80和100μmol/L時，抑制率分別為（0.00±0.00）%、（19.37±2.58）%、（32.58±3.67）%、（48.27±4.25）%、（63.85±5.92）%、（72.88±7.13）%、（80.51±8.68）%，提示人參皂苷Rh4可劑量依賴性抑制Molt4細(xì)胞，IC50為42.75μmol/L，因此，采用42.75μmol/L人參皂苷Rh4進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響 第48、72 h，Rh4組細(xì)胞增殖率顯著低于對照組（P＜0.05），Rh4+LY294002組和LY294002組細(xì)胞增殖率顯著低于Rh4組（P＜0.05），但Rh4+LY294002組和LY294002組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。抑制PI3K/AKT后，人參皂苷Rh4抗增殖作用不顯著，提示人參皂苷Rh4可能通過抑制PI3K/AKT通路抑制Molt4細(xì)胞增殖，見表1。

表1 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

表1 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+LY294002 LY294002 24 h 0.47±0.04 0.41±0.03 0.37±0.03 0.39±0.03 48 h 0.72±0.08 0.58±0.061）0.48±0.06 1）2）0.50±0.05 1）2）72 h 1.19±0.12 0.73±0.081）0.59±0.06 1）2）0.62±0.06 1）2）

2.3 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細(xì)胞凋亡的影響 與對照組［（3.52±0.79）%］相比，Rh4組細(xì)胞凋亡率［（11.89±1.68）%］顯著升高（P＜0.05）。Rh4+LY294002組［（23.36±2.18）%］和LY294002組［（20.31±3.45）%］細(xì)胞凋亡率均顯著高于Rh4組（P＜0.05），但Rh4+LY294002組和LY294002組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用LY294002抑制PI3K/AKT通路后，Rh4對Molt4細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用減弱，提示人參皂苷Rh4通過AKT通路促進(jìn)Molt4細(xì)胞凋亡，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through AKT pathway

2.4 各組細(xì)胞AKT通路磷酸化水平比較 Rh4組細(xì)胞p-AKT/AKT水平（0.82±0.08）顯著低于對照組（1.62±0.13）（P＜0.05），Rh4+LY294002組（0.18±0.02）和LY294002組（0.22±0.02）細(xì)胞p-AKT/AKT水平顯著低于Rh4組（P＜0.05），Rh4+LY294002組和LY294002組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測人參皂苷Rh4對AKT通路磷酸化水平的影響Fig.2 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of AKT pathway

2.5 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響 第48、72 h，Rh4組細(xì)胞增殖率顯著低于對照組（P＜0.05），Rh4+U0126組和U0126組細(xì)胞增殖率顯著低于Rh4組（P＜0.05），Rh4+U0126組和U0126組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，人參皂苷Rh4抗增殖作用減弱，提示人參皂苷Rh4可能通過抑制MEK/ERK通路抑制Molt4細(xì)胞增殖，見表2。

表2 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

表2 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+U0126 U0126 24 h 0.51±0.05 0.43±0.04 0.38±0.04 0.40±0.05 48 h 0.76±0.07 0.61±0.071）0.49±0.071）2）0.53±0.061）2）72 h 1.22±0.13 0.76±0.091）0.61±0.081）2）0.65±0.071）2）

2.6 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細(xì)胞凋亡的影響 Rh4組細(xì)胞凋亡率［（12.24±1.77）%］顯著高于對照組［（3.61±0.86）%］（P＜0.05）。Rh4+U0126組［（18.74±2.64）%］和U0126組細(xì)胞凋亡率［（17.28±2.57）%］均顯著高于Rh4組（P＜0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，Rh4的促細(xì)胞凋亡作用減弱，提示人參皂苷Rh4通過ERK通路促進(jìn)Molt4細(xì)胞凋亡，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through ERK pathway

2.7 各組細(xì)胞ERK通路磷酸化水平比較 如圖4所示，Rh4組細(xì)胞p-ERK/ERK水平（0.81±0.09）顯著低于對照組（1.17±0.12）（P＜0.05），Rh4+U0126組（0.23±0.03）和U0126組（0.30±0.04）細(xì) 胞p-ERK/ERK水平顯著低于Rh4組（P＜0.05），兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 Western blot檢測人參皂苷Rh4對ERK磷酸化水平的影響Fig.4 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of ERK

3 討論

從分子水平上來說，T-ALL是一種異質(zhì)性疾病，遺傳損傷和微環(huán)境因素是引起T-ALL的主要原因。T-ALL是由不成熟的T細(xì)胞前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和克隆擴(kuò)增引起的，成人T-ALL患者占所有T-ALL患者的25%，強(qiáng)化化療方案治療有效率為60%～80%，但多數(shù)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥，預(yù)后較差［8］。

中藥抗腫瘤作用已受到廣泛關(guān)注，研究中藥活性單體化合物的抗腫瘤作用和機(jī)制可更好地發(fā)揮中藥的抗腫瘤作用。人參的生物活性成分已被明確定義，包括人參皂苷、多糖、酚類、類黃酮和聚乙炔等，人參皂苷是根據(jù)薄層色譜中的保留因子值命名的，包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、Rs3、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg4、Rh4和Rh5等，具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、血管生成調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒活性作用［9］。研究顯示，人參皂苷Rh2可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，Rh4具有抗乳腺癌、食道癌等作用［10-12］。本研究初步研究了人參皂苷Rh4對T-ALL的作用，結(jié)果顯示人參皂苷Rh4可劑量依賴性地抑制人T-ALL細(xì)胞系Molt4的生長，在42.75μmol/L時抑制率約為50%。

為進(jìn)一步分析人參皂苷Rh4抑制T-ALL的機(jī)制，課題組分別采用LY294002和U0126抑制PI3K和MEK激酶，從而抑制其下游AKT和ERK蛋白磷酸化激活，抑制AKT和ERK通路。在T-ALL的惡性進(jìn)展和耐藥過程中，AKT和ERK通路均發(fā)揮促進(jìn)作用［13-14］。研究顯示在其他腫瘤中，人參皂苷可抑制AKT及ERK磷酸化［15-16］。本研究通過體外研究證實了人參皂苷Rh4可抑制人T-ALL細(xì)胞系Molt4增殖并促進(jìn)其凋亡，LY294002和U0126可顯著抑制Molt4細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，但在LY294002和U0126基礎(chǔ)上，人參皂苷Rh4對Molt4細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用并不顯著。ZHONG等［17］研究顯示，人參皂苷Rg1可通過調(diào)控FGF2-AKT信號軸緩解衰老小鼠認(rèn)知缺陷。也有研究顯示人參皂苷可通過抑制ERK調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)緩解硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化［18］。提示人參皂苷Rh4可通過抑制AKT和ERK相關(guān)通路發(fā)揮抗T-ALL作用。

綜上所述，人參皂苷Rh4可通過抑制AKT和ERK通路抑制T-ALL細(xì)胞系Molt4增殖并促進(jìn)其凋亡，人參皂苷Rh4的抗T-ALL作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步體內(nèi)實驗研究。