熱炎寧合劑HPLC指紋圖譜研究

蘇永健 劉紅娜 杜鑫 張小華 張仙娟

(1.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043；2.陜西創(chuàng)新醫(yī)藥研究中試工程中心有限公司,陜西 西安 710043)

熱炎寧合劑由清華德人西安幸福制藥有限公司獨家生產，是《中國藥典》2015年版(一部)收錄品種。熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味藥組成。功能為清熱解毒，用于外感風熱、內郁化火所致的風熱感冒、發(fā)熱、咽喉腫痛、口苦咽干、咳嗽痰黃、尿黃便結、化膿性扁桃體炎、急性咽炎、急性支氣管炎、單純性肺炎見上述證候者[1]?，F代研究證明熱炎寧合劑在治療小兒急性上呼吸道感染及扁桃體發(fā)炎時療效顯著[2]。最新研究證明熱炎寧合劑能改善新型冠狀病毒肺炎患者臨床癥狀，促進胸部CT好轉，縮短患者發(fā)熱時間，提高核酸轉陰率[3]。

目前關于熱炎寧合劑質量控制研究的文獻報道較少，主要以虎杖、蒲公英、北敗醬、半枝蓮中化學成分含量檢測為主。據文獻報道：虎杖中主要含蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類以及一些脂肪酸類化合物[4-5]，蒲公英中主要含黃酮類、多糖類、色素類、有機酸類物質[6-9]，北敗醬中主要含黃酮類化合物及酯類和烷烴類成分、三萜類、甾體類、內酯類和有機酸等[10-13]，半枝蓮中主要含黃酮類、二萜類、揮發(fā)油類及多糖等化學成分[14-15]。指紋圖譜技術是近年逐漸發(fā)展起來的一項質量控制技術，它具有信息量大，特征性強，能整體控制多種組分[16-17]。本實驗參照2015年版《中國藥典》(一部)及相關文獻[18-25]，建立了以蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮中化學成分為主要指標的HPLC指紋圖譜，通過共有峰歸屬和指認來控制熱炎寧合劑的質量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260 infinityII型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AG285型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；L-500型離心機(長沙湘儀離心機有限公司)。

1.2試劑與試藥 虎杖苷(批號111575-201603，純度87.3%)，大黃素(批號110756-201512，純度98.7%)，木犀草素(批號111520-201605，純度99.6%)，咖啡酸(批號110885-201703，純度99.7%)，綠原酸(批號110753-201817，純度96.8%)均購于中國食品藥品檢定研究院；熱炎寧合劑(清華德人西安幸福制藥有限公司)；色譜乙腈、色譜甲醇(美國Fisher公司)；磷酸(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；甲醇(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150mm×4.6mm，4μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脫程序(0-35min，10%-35%A，90%-65%B；35-40min，35%-85%A，65%-15%B；40-45min，85%-100%A，15%-0%B；45-50min，100%-10%A，0%-90%B；50-60min，10%-10%A，90%-90%B)；體積流量0.8 mL/min；檢測波長：305nm；柱溫30℃；進樣量10μL。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液制備 取大黃素對照品、虎杖苷對照品、木犀草素對照品、綠原酸對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1mL含大黃素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、綠原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 量取熱炎寧合劑10mL于離心管中，離心(4000轉/min)5分鐘，精密量取2mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇90 mL，超聲30min，至室溫后再加甲醇至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。10批熱炎寧合劑為清華德人西安幸福制藥有限公司生產，樣品批號見表1

表1 樣品信息表

2.2.3陰性樣品溶液 參照2015年版《中國藥典》(一部)熱炎寧合劑提取制備方法，分別制備缺4味藥材的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度考察 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下連續(xù)進樣6針，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性考察 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下于0、2、4、8、12、24h進樣，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<1%，表明供試品溶液24h內穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復性試驗 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<2%，表明該方法重現性良好。

2.4指紋圖譜建立

2.4.1共有峰標定 選取大黃素為參照峰，色譜圖中各色譜峰保留時間與參照峰(S)保留時間的比值為相對保留時間，通過相對保留時間值標定共有峰，其中13個峰為10批樣品共有，標定為共有峰，共有峰見圖1。

圖1 10批熱炎寧合劑樣品HPLC圖

2.4.2相似度評價 共有峰通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)分析，中位數法建立對照指紋圖譜，結果見圖2。10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.980以上，結果見表2。

圖2 對照指紋圖譜

表2 相似度分析結果

2.4.3專屬性考察 分別吸取4種陰性樣品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，色譜圖見圖3。通過與陰性樣比較可以得出1號、2號、3號、5號峰歸屬北敗醬及蒲公英(北敗醬及蒲公英化學成分相似)，4號、6號、7號、10號、11、號12號、13號歸屬虎杖，8號峰歸屬半枝蓮，9號峰屬歸北敗醬。

S1:熱炎寧合劑 S2：虎杖陰性樣 S3：半枝蓮陰性樣 S4：蒲公英陰性樣 S5：北敗醬陰性樣

2.4.4共有峰指認 吸取2.2.1項對照品溶液及2.2.2供試品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，色譜圖見圖4。通過對照品對共有峰進行指認：2號峰為綠原酸, 3號峰咖啡酸, 4號峰為虎杖苷，9號峰為木犀草素，13號峰為大黃素，共指認5個共有峰。

A對照品HPLC圖

3 討論

本試驗采用不同濃度乙醇及甲醇分別對樣品進行超聲處理，并對超聲時間等條件進行考察，結果發(fā)現用甲醇超聲處理30 min后，色譜基線更平穩(wěn)，峰數量較多，因此本實驗采用甲醇超聲處理30 min進行樣品制備。本實驗用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈0.4%磷酸分別做梯度洗脫考察，結果發(fā)現用乙腈-0.1%磷酸進行梯度洗脫，色譜基線平穩(wěn)，各峰分離度較好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作為梯度洗脫流動相。本研究還對流速，檢測波長，柱溫等進行了考察，最后選定流速為0.8 mL/min；檢測波長：305nm；柱溫30℃。

《中國藥典》2015版一部中熱炎寧合劑質量標準中，只對虎杖進行了薄層鑒別，含量測定項也只針對虎杖中的大黃素及虎杖苷進行測定，對處方中蒲公英、北敗醬、半枝蓮沒有制定控制項目，不能全面控制熱炎寧合劑質量。本試驗通過對樣品處理方法，色譜條件的考察，通過10批樣品檢測建立對照指紋圖譜，確認13個共有峰，通過陰性樣品比對，將13個共有峰分別歸屬于4種藥材，本方法較全面反映了熱炎寧合劑中各種成分的分布和比例關系，對更好控制熱炎寧合劑質量發(fā)揮重要作用。