微孔多聚糖止血粉成分及體外生物降解分析

杜寶堂，謝冰瑩，葛 奇，劉曉勇，杜健寧

（1.江蘇奧科生物科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212003；2.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州 215123；3.江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

在不可控出血中，創(chuàng)傷出血和外科手術(shù)失血是日常意外事故中經(jīng)常發(fā)生的事故，出血失控也是導(dǎo)致傷員死亡的重要因素[1-2]。為了避免大量失血，因此開發(fā)出有效、快速并且安全的止血?jiǎng)┰谑鹿尸F(xiàn)場(chǎng)以及院前及時(shí)有效的止血意義重大[3]。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、生物工程的快速發(fā)展，生物止血材料在促進(jìn)傷口愈合方面顯示出巨大潛力[4]。各種類型的止血粉也不斷被開發(fā)出來，其類型逐漸由動(dòng)物源向植物源轉(zhuǎn)化，不可吸收向可吸收轉(zhuǎn)化[5]。其中，微孔多聚糖止血粉是一種自主研發(fā)的新型高分子材料，主要是由馬鈴薯植物淀粉經(jīng)過變性處理后所制成的微孔多聚糖淀粉顆粒[6]，可通過立即吸收血液中的液體成分以及濃縮血小板和凝血因子來實(shí)現(xiàn)，具有良好吸附凝血成分的效果[7]，起到加速內(nèi)源性凝血過程，從而達(dá)到快速的術(shù)中止血目的。其作為一種來源于植物淀粉的材料，理論上來說是非常安全的[8]，并且在人體傷口處施用后，最終會(huì)被組織以及體液中相應(yīng)的酶分解，形成單糖等機(jī)體正常所需成分，最終被機(jī)體所代謝出體外[9]。生物相容性和高效止血材料的開發(fā)可以被視為術(shù)中和術(shù)后快速止血的最佳方法[10]。2004年，Murat等[11]首次描述了植物性淀粉來源的止血?jiǎng)?。目前，可吸收止血?jiǎng)┮呀?jīng)成為外科醫(yī)療設(shè)備的重要組成部分，用于處理術(shù)中出血[12]。鑒于這些止血?jiǎng)┠軌蛴行M足外科手術(shù)過程的基本需求，新的止血?jiǎng)┎粩嚅_發(fā)，其安全性也是最為關(guān)注的。

止血粉的商業(yè)信息表明，它們?cè)谕饪剖中g(shù)中被用作控制毛細(xì)血管、靜脈和小動(dòng)脈出血的輔助止血?jiǎng)13]。成功的止血對(duì)于最大限度地減少與一般外科手術(shù)有關(guān)的圍手術(shù)期發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要[14]。在外科手術(shù)過程中，當(dāng)無法通過常規(guī)方法控制出血時(shí)，通常使用外科止血?jiǎng)┳鳛檩o助手段，該方法可以實(shí)現(xiàn)快速止血的安全性和有效性，易于使用且能夠在大傷口中形成持久止血并且對(duì)血源性疾病沒有任何風(fēng)險(xiǎn)。Giday等研究證實(shí)了止血粉末可以在動(dòng)物動(dòng)脈出血中的實(shí)現(xiàn)初始止血，而且沒有腸梗阻或意外的管腔效應(yīng)，沒有局部或局部顆粒效應(yīng)，沒有全身栓塞效應(yīng)，也沒有全身凝血作用[15]。在臨床上，這種多聚糖止血粉在內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)[16，17]、皮膚外科手術(shù)[18]和腹腔鏡手術(shù)中[19]表現(xiàn)了出色的效果。目前國(guó)內(nèi)尚無同類具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品面市。因此，本文重點(diǎn)探討微孔多聚糖止血粉的主要成分以及止血粉生物降解的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為臨床使用止血粉提供代謝依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

微孔多聚糖止血粉。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備

止血粉樣品在烘箱中50℃烘至恒重后，稱量3份，每份稱取約5.0mg，分別溶于1mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，配成濃度5mg/mL。100℃下降解12h，分別取200μL降解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除酸解樣品中的TFA，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，加水定容于20mL容量瓶，配成上樣濃度50×10-6，0.22μm濾膜過濾備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

配制100×10-6的葡萄糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及其混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；配制7個(gè)濃度梯度葡萄糖和麥芽糖二者的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，葡萄糖濃度分別為0.1×10-6、0.5×10-6、1×10-6、2×10-6、4×10-6、8×10-6和10×10-6，麥芽糖濃度分別為1×10-6、5× 10-6、10×10-6、20×10-6、40×10-6、80×10-6、100×10-6；進(jìn)樣量為20μL；采集時(shí)間為40min。

1.2.3 止血粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

將止血粉配成母液濃度為1mg/mL，沸水溶解，冷卻至室溫，再將母液倍比稀釋成0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.062 5mg/mL和0.031 25mg/mL的溶液，分別取200μL加入至96孔板，然后再分別加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混勻后立即采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在610nm處測(cè)其吸收度（A值），繪制淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 止血粉體外酶解

稱取定量止血粉于烘箱中50℃烘至恒重。配制20mmol/L NaH2PO4和6.7mmol/L NaCl溶 液，用1mol/L NaOH/HCl調(diào)節(jié)pH為6.9，稱量止血粉110.8mg，用上述緩沖液配成止血粉濃度為1mg/mL。加入30.7mg CaCl2（~2.5mmol/L），于沸水中溶解5min，冷卻至室溫。分別取出3份各3mL溶液，作為酶降解0h的樣品。剩余溶液中加入3mgα-淀粉酶粉末，混勻。把上述已加α-淀粉酶溶液分裝于三個(gè)相同的50mL EP管中（3個(gè)平行樣），每管33mL。放入37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行降解，分別作用1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h、36h、48h后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3mL樣品，100℃煮沸除酶活性。其中1mL樣品于12 000r/min離心15min，取上清液，超純水稀釋10倍至止血粉濃度為100×10-6用于離子色譜分析；其余2mL樣品滅酶活后不離心直接用于止血粉淀粉含量測(cè)定，每個(gè)樣品分別取3份200μL轉(zhuǎn)移至96孔板，然后分別加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混勻后立即采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在610nm處測(cè)其吸收度（A值）。

2 結(jié)果

2.1 果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖的確定

如圖1所示，酸降解止血粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合離子色譜分離條件下，果糖和葡萄糖的保留時(shí)間分別為14.9min和10.5min；葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=34.416x-8.551，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7。

圖1 果糖和葡萄糖離子色譜圖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 葡萄糖和麥芽糖的離子色譜圖確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2所示，在酶降解止血粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合離子色譜分離條件下，葡萄糖和麥芽糖的保留時(shí)間分別為7.68min和16.06min。葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=42.037x-1.261，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999；麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=19.884x+28.550，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999；止血粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.442x+0.182，線性相關(guān)系數(shù)為0.9963。

圖2 葡萄糖、麥芽糖及其混合標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖及葡萄糖，麥芽糖和止血粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 止血粉酸降解后單糖譜圖分析

止血粉酸降解后的單糖分析譜圖見圖3，單糖的保留時(shí)間在10.5min，說明單糖為葡萄糖。因此采用三氟乙酸降解止血粉得到的單糖皆為葡萄糖，葡萄糖的含量為（54.3±1.5）×10-6，如表1所示。由于葡萄糖分子量為180，淀粉是葡萄糖脫水（分子量18）聚合而成，因此通過葡萄糖含量折算至淀粉含量應(yīng)乘上系數(shù)0.9。淀粉中單糖為葡萄糖的含量為97.8%± 2.6%。

圖3 止血粉降解后單糖分析譜圖

表1 止血粉酸降解后葡萄糖含量

2.4 止血粉酶解結(jié)果分析

止血粉在37℃水中溶解度小，呈混懸液。100℃加熱5min后，分成上下兩層，上層溶液澄清，下層少量止血粉呈現(xiàn)溶脹狀態(tài)。此外，若酶解產(chǎn)物的保留時(shí)間為7.7min，說明產(chǎn)物為葡萄糖；若酶解產(chǎn)物的保留時(shí)間為16.1min，說明產(chǎn)物為麥芽糖；保留時(shí)間為14.5min為α-淀粉酶中乳糖；其他保留時(shí)間的酶解產(chǎn)物為不同聚合度的寡糖。降解產(chǎn)物中葡萄糖、麥芽糖和乳糖的離子色譜峰面積見表2，降解產(chǎn)物中葡萄糖含量見表3，降解產(chǎn)物中麥芽糖的含量，如表4所示；止血粉α-淀粉酶降解不同時(shí)間后產(chǎn)物中未降解淀粉含量，如表5所示。

表2 止血粉不同降解時(shí)間離子色譜中葡萄糖、麥芽糖和乳糖峰面積（（nA）×min）

表3 止血粉不同降解時(shí)間產(chǎn)物中葡萄糖的含量（x±SD，n=3）

表4 止血粉不同降解時(shí)間產(chǎn)物中麥芽糖的含量（x±SD，n=3）

表5 止血粉不同降解時(shí)間產(chǎn)物中未降解淀粉的含量（x±SD，n=9）

續(xù)表

因此，止血粉在37℃α-淀粉酶作用下，淀粉含量隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)逐步減少，從即時(shí)的95.6%至48h的8.0%，1h內(nèi)降解速率最大，約降解了67.3%。降解產(chǎn)物中除有葡萄糖單糖、麥芽糖雙糖外，還有寡糖；離子色譜圖中乳糖為α-淀粉酶中物質(zhì)，在降解的48h乳糖含量保持不變。100×10-6止血粉在37℃α-淀粉酶作用下，葡萄糖的含量從即時(shí)的0至48h的4.004×10-6，麥芽糖的含量從即時(shí)的0ppm至48h的44.692×10-6，1h內(nèi)麥芽糖生成速率最大，增加了36.509×10-6。

3 結(jié)論

本研究是按照《可吸收止血產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》要求，在體外研究微孔多聚糖止血粉的成分以及生物降解，分別利用酸降解和生物降解法對(duì)微孔多聚糖止血粉進(jìn)行體外降解研究。通過離子色譜法體外測(cè)定三氟乙酸降解微孔多聚糖止血粉生成的單糖，從而確定了止血粉的成分。隨后采用離子色譜和分光光度法測(cè)定該止血粉在37℃、pH=6.9和Ca2+存在條件下，經(jīng)過α-淀粉酶作用后所產(chǎn)生的葡萄糖，麥芽糖和淀粉含量，進(jìn)一步確定止血粉的生物降解特性。在酸降解止血粉過程中，由于淀粉是葡萄糖分子聚合而成的，因此淀粉又被分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大類型。直鏈淀粉沒有分支的螺旋結(jié)構(gòu)，支鏈淀粉具有24~30個(gè)葡萄糖殘基以α-1，4-糖苷鍵首尾相連而成，在支鏈處為α-1，6-糖苷鍵。所以經(jīng)過酸降解后，能夠形成單糖結(jié)構(gòu)。本次所采用三氟乙酸降解止血粉的結(jié)果也表明得到的單糖皆為葡萄糖，且葡萄糖的含量為（54.3±1.5）×10-6，且淀粉中單糖為葡萄糖的含量為97.8%±2.6%。

在進(jìn)行體外酶降解止血粉時(shí)，主要選用了血清淀粉酶，也被稱之為淀粉內(nèi)切酶，這是一種α-淀粉酶，在生物體內(nèi)主要是由胰腺和唾液腺分泌。相關(guān)研究表明，α-淀粉酶從人唾液和豬胰腺中得到的α-淀粉酶的最適pH為6.0~7.0。此外，α-淀粉酶以Ca2+為必需因子并作為穩(wěn)定因子，既可以作用于直鏈淀粉，又能夠作用于支鏈淀粉，可以無差別地切斷α-1,4-鏈。其特征主要是能夠引起淀粉溶液黏度的急劇下降和碘反應(yīng)的消失，最終分解直鏈淀粉時(shí)產(chǎn)物以麥芽糖為主，此外，還有麥芽三糖及少量葡萄糖；分解支鏈淀粉時(shí)，產(chǎn)物除麥芽糖、葡萄糖外，還生成分支部分具有α-1,6-鍵的α-極限糊精。止血粉在經(jīng)過48h的體外α-淀粉酶的作用之后，所含淀粉含量逐漸降低，1h之內(nèi)淀粉降解速率最大為67.3%，生物降解產(chǎn)物中除了含有單糖葡萄糖以外，還含有雙糖麥芽糖以及少許寡糖分子。并且麥芽糖含量在1h之內(nèi)的增加速率最大為81.69%。

對(duì)于此類微孔多聚糖止血材料的生物降解性研究也較多，Rong等[4]對(duì)一種新型的止血栓塞復(fù)合生物材料可降解止血?jiǎng)┠肛?fù)載的海藻酸鈣微球（TACMs）進(jìn)行研究，結(jié)果表明其可以在體內(nèi)生物降解并且沒有細(xì)胞毒性和全身毒性。Shi等[10]對(duì)復(fù)合微孔多聚糖止血粉的體外研究也表明該類型止血材料具有良好的可降解性以及安全性。Tschan等[7]研究證實(shí)微孔多聚糖止血材料在神經(jīng)外科手術(shù)中也是十分安全有效的。并且Singh等[20]的研究表明微孔多聚糖的止血效果比普通明膠基質(zhì)的止血效果好。因此，認(rèn)為這些生物來源、無毒、親水性高、生物相容性和生物降解性良好的微孔多聚糖止血材料可以應(yīng)用于臨床及術(shù)中快速止血。而本研究所用到的微孔多聚糖止血粉在體外生物降解后，主要成分是葡萄糖及麥芽糖等，這些成分均是人體所需的能量物質(zhì)，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性，體外代謝結(jié)果表明使用微孔多聚糖止血粉1h之內(nèi)即可被機(jī)體所代謝，這也為今后微孔多聚糖止血粉在臨床的使用提供了代謝依據(jù)。