不同炮制方法對雷公藤中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的影響

張奉蘇，房克慧，陳宏降，田 靜，張 柳，羅益遠(yuǎn)*

（1.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州225000；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，寧波315500；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023）

雷公藤（Tripterygium wilfordii）系衛(wèi)矛科植物雷公藤的去皮根及根莖，又名黃藤、黃藤木、斷腸草等。雷公藤首見于《本草綱目拾遺》，主產(chǎn)于福建、江西、湖北等地。具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、清熱解毒功效，主要用于風(fēng)濕頑痹、癰瘡腫毒等病癥治療。化學(xué)成分主要包括二萜類、三萜類、生物堿類、倍半萜類以及糖類等[1-2]?，F(xiàn)代研究表明雷公藤也具有多種藥理活性，臨床多用于治療自身免疫性疾病及各種皮膚病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎紅斑狼瘡等[3-4]，但是雷公藤的有效成分同時也是有毒成成分，臨床觀察中，雷公藤易發(fā)生胃腸道、血液和造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、肝臟、腎臟等多種器官發(fā)生的不良反應(yīng)[4-7]。炮制是雷公藤提高藥效、降低毒副作用且方便存儲的方法。為了確保臨床廣泛而安全的用藥，運用炮制方法對雷公藤進(jìn)行增效減毒至關(guān)重要的[8-9]。雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素是雷公藤藥材中的主要有效成分，且含量相對較穩(wěn)定，目前多用作控制雷公藤藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分[10-11]。本文在前期研究基礎(chǔ)上[12]，以雷公藤藥材及其不同炮制品為研究對象，建立同時測定雷公藤中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的分析方法，比較不同炮制方法對雷公藤中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素含量的影響，及炮制前后雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲兩組分的含量變化，以期為后續(xù)雷公藤減毒增效研究提供基礎(chǔ)資料。

1 儀器和試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent chemstation工作站（美國安捷倫公司）；KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾利超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；恒溫水浴鍋。

雷公藤內(nèi)酯甲對照品（批號為LLH2-7RDS，純度≥99%）購自于中國食品藥品檢定研究院，雷公藤甲素對照品（批號為111567-200502，純度≥99%）購自于中國藥品生物制品檢定所；雷公藤（雷公藤去皮根藥材、雷公藤根皮藥材）于2016年采收于福建泰寧；甲醇為分析純，三氯甲烷為分析純，柱層析硅膠為60-100目，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同炮制品的制備

生品：取雷公藤藥材，去根皮，切制成厚片，干燥；

炒炙：取雷公藤厚片置鍋內(nèi)，文火炒至有固有氣味逸出，雷公藤厚片表面顏色加深，取出，干燥；

酒炙：稱取雷公藤厚片100 g，置適宜容器中，加黃酒30 g拌勻，悶潤2 h，置炒鍋內(nèi)，用文火炒干，取出，干燥；

醋炙：稱取雷公藤厚片100 g，置適宜容器中，加米醋30 g拌勻，悶潤2 h，置炒鍋內(nèi)，用文火炒干，取出，干燥；

蒸制：稱取雷公藤厚片100 g，裝入蒸鍋內(nèi)隔水蒸制4 h后取出，置烘箱內(nèi)（40℃）烘干；

萊菔子汁煮：稱取萊菔子10 g，加水分兩次煎煮，過濾，合并濾液至200 mL；稱取雷公藤厚片100 g置于鍋內(nèi)，倒入萊菔子汁，武火煮沸后文火煮至藥透汁盡，取出，置烘箱內(nèi)（40℃）烘干；

甘草汁煮：稱取甘草10 g，加水分兩次煎煮，過濾，合并濾液至200 mL；稱取雷公藤厚片100 g置于鍋內(nèi)，倒入甘草汁，武火煮沸后用文火煮至藥透汁盡，取出，置烘箱內(nèi)（40℃）烘干；

水煮：稱取雷公藤厚片置鍋內(nèi)，加水浸泡至內(nèi)無干心，水沒過藥面，武火煮沸后用文火煮至內(nèi)無白心，置烘箱內(nèi)（40℃）烘干。

2.2 色譜條件

色譜柱：Inertstill ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：A為0.1%磷酸乙腈，B為0.2%三乙胺水溶液；梯度洗脫（0-15 min，10%-33%A；15-22 min，

33%-33%A；22-30min，33%-50%A；30-40 min，50%-85%A；40-55 min，85%-95%A；55-60 min，95%-95%A；60-65 min，95%-10%A）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。對照品與樣品的HPLC色譜圖見圖1。

注：1-雷公藤甲素（Triptolide）；2-雷公藤內(nèi)酯甲（Wilforlide A）

2.3 混合對照品溶液制備

精密稱取雷公藤內(nèi)酯甲14.26 mg，雷公藤甲素12.26 mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻即得。其中雷公藤內(nèi)酯甲濃度為285.2μg/mL、雷公藤甲素濃度為245.2μg/mL。

2.4 供試品溶液制備

將各雷公藤樣品干燥粉碎（過40目篩），分別取約15g，精密稱定，加甲醇水浴回流提取2次每次60 mL，過濾，合并濾液，濃縮至5mL，用硅膠拌樣，取8.0 g硅膠干法裝柱（10 cm×1.5 cm）上柱，氯仿-甲醇（97∶3）50 mL洗脫，洗脫液濃縮至干后用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

精密量取“2.3”項下的混合對照品溶液0.5、2、3、4、5mL分別置于20mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取混合對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件，分別進(jìn)樣20μL。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得回歸方程及線性范圍見表1。以各化合物3倍信噪比計算各組分的檢出限；以各化合物10倍信噪比計算各組分的定量限。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1 Calibration cure and results of LOD and LOQ

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗

量取“2.3”項下的混合對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并記錄雷公藤內(nèi)酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面積，計算其RSD分別為1.1%和1.2%，表明儀器的精密度良好；取雷公藤生品供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h分別進(jìn)樣，記錄雷公藤內(nèi)酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面積，計算其RSD分別為0.8%和1.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。取雷公藤生品粉末6份，精密稱定，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，測定并記錄雷公藤內(nèi)酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面積，計算其RSD分別為0.7%和0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.2 加樣回收試驗

取已知含量的雷公藤萊菔子汁煮供試品溶液9份，精密稱定，各加入適量的雷公藤內(nèi)酯甲對照品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液；同法制備雷公藤甲素的供試品溶液，測定并計算供試品溶液中對照品的含量，計算平均加樣回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

表2 方法學(xué)測定結(jié)果Table 2 Results of methodological

2.7 樣品測定

取雷公藤生品、根皮和7個炮制品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定。按外標(biāo)法計算（以干燥品計）得生品、根皮及各炮制品中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的含量，結(jié)果見表3。

表3 雷公藤不同炮制品中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的測定結(jié)果（μg/g，n=3）Table 3 Content of Triptolide and Wilforlide A in different samples(μg/g，n=3)

3 小結(jié)與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

在本實驗考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，0.1%磷酸乙腈-0.2%三乙胺水溶液梯度洗脫等多種流動相組成，結(jié)果表明0.1%磷酸乙腈-0.2%三乙胺水溶液梯度洗脫較其他幾種流動相有較好的分離度，峰對稱性較好。采用等度洗脫難以將兩種指標(biāo)成分良好分離，因此采用梯度洗脫法，并且考察不同的洗脫程序。

3.2 樣品制備方法確定

對雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的提取純化工藝進(jìn)行了探究及優(yōu)化，考察了5種提取純化工藝：甲醇超聲提取30分鐘、氯仿超聲提取30分鐘、甲醇回流提取2次-硅膠柱純化、甲醇回流提取2次-硅膠拌樣-氯仿超聲、甲醇回流提取2次-硅膠拌樣-氯仿超聲-硅膠柱純化。結(jié)果顯示直接用甲醇回流提取后經(jīng)硅膠柱純化，待測組分的提取效果較差，分離效果不理想；甲醇回流后，硅膠拌樣用氯仿超聲提取，提取效果同樣不理想，若未經(jīng)硅膠柱純化，易污染液相色譜柱，且分離效果不佳。因此筆者選用甲醇回流提取2次-硅膠拌樣-氯仿超聲濾取-硅膠柱純化。同時對采用硅膠柱純化時的硅膠用量進(jìn)行了考察：分別取4、6、8、10 g硅膠對同一樣品進(jìn)行分離純化，最終發(fā)現(xiàn)硅膠取樣量為8 g時分離純化效果最好，且分離效率較高。

3.3 實驗結(jié)果分析

雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素是雷公藤藥材中的主要有效成分，且含量相對較穩(wěn)定，目前多用于雷公藤藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。本實驗采用反相高效液相色譜法有效的實現(xiàn)了這兩種有效成分的良好分離，較準(zhǔn)確地測定其在不同炮制品中的含量。結(jié)果表明，不同炮制品中這兩種有效成分的含量較生品都有所降低，其中雷公藤甲素的變化較雷公藤內(nèi)酯甲的變化大，酒炙品和醋炙品中雷公藤內(nèi)酯甲含量降低較明顯，醋炙品、酒炙品和清炒品中雷公藤甲素的含量變化較大，相比較而言，萊菔子汁煮品和蒸制品對雷公藤中主要成分含量影響較小。實驗結(jié)果表明，雷公藤根皮生品中雷公藤內(nèi)酯甲的含量明顯高于雷公藤藥材中，進(jìn)一步表明，雷公藤根皮毒性高于雷公藤藥材，不同的炮制方法對其指標(biāo)性成分的降低有一定的作用。

本實驗建立高效液相色譜發(fā)法同時測定不同雷公藤炮制品中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的含量進(jìn)行比較分析。該方法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為雷公藤藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供可靠的檢測方法。就本實驗而言，采用不同的炮制方法對雷公藤主要有效成分的含量有一定影響，酒炙的方法可以同時明顯降低生品中雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲的含量，其次是醋炙和甘草汁煎煮。