采用二喹啉甲酸法定量檢測(cè)殘留醫(yī)用多酶清洗劑

唐媛 李丹 錢紅梅 陳燕燕，3 秦蕾 池在龍，3

復(fù)用眼科手術(shù)器械的清洗必須使用清洗劑，而正確使用清洗劑可提高眼科手術(shù)器械的清洗效果。醫(yī)用多酶清洗劑對(duì)有機(jī)物具有高效的去除效果，現(xiàn)已成為復(fù)用眼科手術(shù)器械清洗的首選。本課題組前期對(duì)全國(guó)127家醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有超過(guò)60%的醫(yī)院在清洗眼科手術(shù)器械時(shí)使用醫(yī)用多酶清洗劑[1]。一旦有醫(yī)用多酶清洗劑殘留，即使非常微量也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的眼部術(shù)后并發(fā)癥。Parikh等[2]發(fā)現(xiàn)殘留的醫(yī)用多酶清洗劑可能導(dǎo)致角膜水腫和眼內(nèi)炎癥。多名學(xué)者研究報(bào)道醫(yī)用多酶清洗劑殘留于眼科手術(shù)器械可能會(huì)導(dǎo)致眼前節(jié)毒性反應(yīng)綜合征（Toxic anterior segment syndrome，TASS）的發(fā)生[3-5]。因此，為確保眼科手術(shù)的安全，有必要對(duì)眼科臨床常用的醫(yī)用多酶清洗劑進(jìn)行科學(xué)可靠的檢測(cè)和定量分析。

但目前臨床上還沒(méi)有一種針對(duì)醫(yī)用多酶清洗劑殘留的科學(xué)的定量檢測(cè)方法，查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及指南[6-10]，均未發(fā)現(xiàn)醫(yī)用多酶清洗劑殘留的定量檢測(cè)方法。本研究采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法對(duì)醫(yī)用多酶清洗劑殘留進(jìn)行定量檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、回收率，為多酶洗滌用品在眼科臨床上更加安全規(guī)范的使用提供依據(jù)和保證。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

醫(yī)用多酶清洗劑：主要有效成分包括脂肪酶、蛋白酶、糖酶、淀粉酶、高級(jí)蛋白水解酶、協(xié)同酶和生化酶等（Endozime KWZ035001 XBJ1，美國(guó)魯沃夫公司）；BCA試劑盒（P0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；醫(yī)療器械干燥箱（LWYL-400D，重慶優(yōu)瑪醫(yī)療科技有限公司）；96孔板（廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司）；酶標(biāo)儀（Spectramax M5，上海美谷分子儀器公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司）。

1.2 方法

1.2.1 BCA工作液及標(biāo)準(zhǔn)液的配制 參照BCA試劑盒說(shuō)明書，將A液和B液以50∶1 的比例充分混勻，配制得到BCA工作液。將25 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)（Bovine serum albumin，BSA）稀釋至0.5 mg/ml，用滅菌水對(duì)其梯度稀釋，配制成濃度梯度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml的BCA系列標(biāo)準(zhǔn)液。每次實(shí)驗(yàn)現(xiàn)配現(xiàn)用，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線和計(jì)算回歸方程。

1.2.2 醫(yī)用多酶清洗劑樣品的配制 將醫(yī)用多酶清洗劑原液分別按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300的比例與純水混合，配制成各濃度梯度的醫(yī)用多酶清洗劑樣品。

1.2.3 BCA法測(cè)定步驟 在96孔板中依次加入200 μl的BCA工作液，再依次加入BCA系列標(biāo)準(zhǔn)液和檢測(cè)樣品20 μl，充分混勻后，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出，用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液和樣品在562 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光度計(jì)算出所測(cè)樣品的蛋白濃度。

1.2.4 BCA測(cè)量的方法學(xué)考察 BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的重現(xiàn)性試驗(yàn)：于不同時(shí)刻配制BCA系列標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。

BCA法回收試驗(yàn)：取濃度為100、500 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白各20 μl與200 μl的BCA工作液混勻，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育30 min，重復(fù)8次，分別測(cè)定100、500 μg/ml蛋白水平的回收率。

BCA法定量醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度試驗(yàn)：取醫(yī)用多酶清洗劑原液、1∶50 及1∶100 稀釋的醫(yī)用多酶清洗劑樣品，各8份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光度求取所測(cè)樣品的蛋白濃度，計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差系數(shù)（Relative standard deviation，RSD）。

BCA法定量不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度變化試驗(yàn)：取適量醫(yī)用多酶清洗劑原液，1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300稀釋的醫(yī)用多酶清洗劑樣品，每個(gè)樣品測(cè)量3次取均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品中的酶蛋白濃度，繪制不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度變化柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。采用EpiData 3.1 建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行平行雙錄入，同時(shí)建立核查文件，進(jìn)行計(jì)算機(jī)邏輯核查。采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究計(jì)量指標(biāo)數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation，SD）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。本研究規(guī)定RSD＜5%。BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算采用最小二乘法進(jìn)行線性相關(guān)與回歸分析，本研究規(guī)定每條標(biāo)準(zhǔn)曲線波長(zhǎng)的R2＞0.95。

2 結(jié)果

2.1 BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)液在562 nm處的OD值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），顯示OD 值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度呈正相關(guān)，回歸方程為=0.0009X+0.0955，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

2.2 BCA法的準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的重現(xiàn)性試驗(yàn) 于不同時(shí)刻配制BCA系列標(biāo)準(zhǔn)液，共制作5次標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)表1），相關(guān)系數(shù)R2均＞0.95，可見(jiàn)波長(zhǎng)為562 nm時(shí)，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系且重復(fù)性好。

圖1.二喹啉甲酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1.BCA Standard curve.

表1.二喹啉甲酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與R2值Table 1.Regression equation of the standard curve of BCA and R2 value

2.2.2 BCA法回收試驗(yàn) 濃度為100、500 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白通過(guò)BCA 法測(cè)定的回收率分別為104.6%～112.8%、96.7%～102.2%，平均回收率分別為109.2%、99.8%，RSD分別為2.518%、2.123%。2種標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度測(cè)定的回收率RSD均＜3%（見(jiàn)表2），表明BCA法在樣品處理過(guò)程中損失少，重復(fù)性好，具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度有較高的可信度。

2.3 BCA法定量分析醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度

測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算醫(yī)用多酶清洗劑樣品中的酶蛋白濃度。未稀釋原液，1∶50、1∶100比例稀釋醫(yī)用多酶清洗劑樣品中平均酶蛋白濃度依次為611、39、25 μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)差依次為20.591、1.872、0.927 μg/ml，RSD依次為3.372%、4.832%、3.730%，3 組樣品中的酶蛋白濃度的RSD均＜5%，說(shuō)明BCA法檢測(cè)醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。見(jiàn)表3。

2.4 BCA法定量不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中酶蛋白的濃度變化

將醫(yī)用多酶清洗劑稀釋成6 個(gè)不同濃度梯度，結(jié)果顯示稀釋比例在1∶50～1∶200范圍內(nèi)，酶蛋白濃度隨著醫(yī)用多酶清洗劑稀釋比例的增大而呈線性下降（見(jiàn)圖2），將622 μg/ml的醫(yī)用多酶清洗劑原液稀釋至1∶200及以上時(shí)，酶蛋白濃度接近穩(wěn)定。

表2.100 μg/ml和500 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白的回收率測(cè)定結(jié)果Table 2.Recoveries of 100 and 500 μg/ml standard protein

表3.醫(yī)用多酶清洗劑中酶蛋白濃度的定量分析結(jié)果Table 3.Quantitative analysis of enzyme protein concentration in medical multi-enzyme detergent

圖2.醫(yī)用多酶清洗劑不同比例稀釋后的酶蛋白濃度變化趨勢(shì)圖采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y^=0.0008X+0.1011，R2=0.9995Figure 2.Trend of enzyme protein concentration after different ratio dilution of medical multi-enzyme detergent.Linear regression equation of BCA standard curve is =0.0008X+0.1011,R2=0.9995.

3 討論

眾所周知，殘留的醫(yī)用多酶清洗劑可致使眼內(nèi)炎、TASS等嚴(yán)重的眼部疾病。如何對(duì)醫(yī)用多酶清洗劑殘留進(jìn)行精確可靠的定量檢測(cè)成為臨床上面臨的一大難題。目前，醫(yī)用多酶清洗劑的檢測(cè)方法有定量和定性檢測(cè)，以定性檢測(cè)為主，如電泳法[11]及化學(xué)一般顯色法等。有學(xué)者采用掃描電鏡法（Scanning electron microscopy，SEM）結(jié)合能量色散X射線光譜分析（Energy dispersive spectroscopy，EDS）[12，13]，該法雖可確定醫(yī)用多酶清洗劑中蛋白的元素組成，但因設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，目前仍停留于實(shí)驗(yàn)研究階段。也有學(xué)者提出總有機(jī)碳檢測(cè)法（Total organic carbon，TOC）[14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]，雖可定量估算醫(yī)用多酶清洗劑中的蛋白含量，但因?qū)嶒?yàn)周期長(zhǎng)且存在不確定性，因此不適合在臨床開(kāi)展。

BCA法通過(guò)測(cè)量吸光度來(lái)確定蛋白質(zhì)的含量，已成為一種常用的定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法[16]，而常見(jiàn)的醫(yī)用多酶清洗劑中的酶本質(zhì)就是蛋白質(zhì)。本研究首次將BCA法應(yīng)用于醫(yī)用多酶清洗劑的定量檢測(cè)中，基于大量的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)采用BCA法來(lái)檢測(cè)醫(yī)用多酶清洗劑殘留時(shí)具有良好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性及回收率（見(jiàn)圖1 和表1 ─3）。圖2 表明醫(yī)用多酶清洗劑在臨床使用過(guò)程中，最佳配比濃度為1∶200～1∶300，這與該清洗劑說(shuō)明書要求的配比濃度（1∶270）相似。在此范圍內(nèi)，醫(yī)用多酶清洗劑含有相似的酶蛋白濃度，對(duì)手術(shù)器械具有穩(wěn)定的清潔功效。

綜上所述，本研究證明BCA法不僅可以通過(guò)目測(cè)試劑顏色的變化來(lái)快速作出定性判斷，還可以通過(guò)紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀的檢測(cè)來(lái)定量分析醫(yī)用多酶清洗劑的濃度。且BCA法在臨床應(yīng)用過(guò)程中具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、方便快捷、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為醫(yī)用多酶清洗劑殘留的定量檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供新的思路，填補(bǔ)了指南和規(guī)范的缺陷，可推薦應(yīng)用于臨床工作，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)清洗后臨床眼科手術(shù)器械表面醫(yī)用多酶清洗劑的殘留情況，預(yù)防和控制醫(yī)源性感染的發(fā)生。本研究也存在著一定的不足，多酶清洗劑成分復(fù)雜，可能存在一些影響B(tài)CA法定量測(cè)定的物質(zhì)，如蛋白增敏劑[17]、還原性物質(zhì)[18，19]。在本項(xiàng)研究中，這些干擾物質(zhì)未被去除。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)沉淀蛋白質(zhì)[20]和調(diào)整樣品pH值[21]等方法，有效消除多酶清洗劑中各干擾物質(zhì)對(duì)BCA法測(cè)定結(jié)果的影響，從而更精準(zhǔn)地測(cè)定多酶清洗劑中酶蛋白的濃度。

利益沖突申明本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明唐媛：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行修改。李丹、錢紅梅、秦蕾：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修。陳燕燕、池在龍：參與選題、設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果、結(jié)論