黃芪多糖調(diào)節(jié)脂聯(lián)素/TLR/NF-κB信號通路對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用①

宋 艷 何永恒 楊 芳 羅 敏 劉 楊（湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院肛腸科，長沙410005）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性腸病，可見于任何年齡段人群，以20～30歲較為多見［1］。脂聯(lián)素∕TLR∕NF-κB是調(diào)節(jié)機體炎癥信號傳遞的信號轉(zhuǎn)導通路，研究發(fā)現(xiàn)其與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制密切相關(guān)［2］。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，AP）是從傳統(tǒng)中藥材黃芪中提取得到的多糖類物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用［3］。近年來有學者發(fā)現(xiàn)其對潰瘍性結(jié)腸炎具有一定的治療及改善作用，但其作用機制有待研究［4］。本文通過研究AP對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的改善作用及脂聯(lián)素∕TLR∕NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為AP在潰瘍性結(jié)腸炎中的藥理作用及機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康雄性C57BL∕6小鼠，清潔級，6～8周齡，體重20～22 g，湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物房溫度22～24℃，濕度40%～75%，適應(yīng)1周。藥品及試劑：AP（黃芪產(chǎn)于內(nèi)蒙古，由南京澤朗醫(yī)藥科技集團有限公司提取分離，分子量254.693，純度＞90%）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司）；P-選擇素、MIF及TXB2（武漢華美生物工程有限公司）；RIPA蛋白裂解液、RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、TLR4兔多克隆抗體、NF-κBp65及GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、生物素標記山羊抗兔IgG購自碧云天生物科技有限公司；小鼠髓過氧化物酶（MPO）ELISA試劑盒購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司；蘇木素染液、伊紅染液均購自源葉生物科技有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自美國Sciencell公司；TGF-β1 ELISA試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的建立及給藥90只小鼠隨機分為對照組、模型組、AP低、中、高劑量組及陽性對照組，15只∕組。除對照組外，其余小鼠自由飲用當日現(xiàn)配的質(zhì)量分數(shù)為3%DSS溶液連續(xù)7 d建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型［5］。按照Cooper評分系統(tǒng)［6］根據(jù)小鼠體重減輕、大便性狀、便血情況評定小鼠結(jié)腸組織疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI），同時隨機取3只小鼠對結(jié)腸組織做病理學檢查，以DAI升高及小鼠結(jié)腸病理性改變視為造模成功。根據(jù)前期預實驗結(jié)果并參照文獻確定給藥劑量，AP低、中、高劑量組分別灌胃給予100 mg∕kg、200 mg∕kg、400 mg∕kg AP，陽性對照組灌胃給予300 mg∕kg柳氮磺吡啶（參照臨床給藥劑量的6.2倍及文獻方法確定劑量），1次∕d，連續(xù)給藥14 d，對照組及模型組小鼠給予生理鹽水［5，7］。小鼠末次給藥24 h后，評定DAI。

1.2.2 小鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平的測定 斷尾取血，4℃靜置4 h，4℃下3 500 r∕min離心10 min，取上清，使用ELISA試劑盒檢測血清TNFα、IL-6及TGF-β1水平。

1.2.3 小鼠結(jié)腸組織SOD、MPO活性、MDA、P-選擇素、MIF及TXB2水平的測定 取小鼠結(jié)腸組織，按照試劑盒說明書檢測SOD、MPO活性、MDA、P-選擇素、MIF及TXB2水平。

1.2.4 HE染色檢查結(jié)腸組織病理學變化 取厚度為5 μm的小鼠結(jié)腸組織石蠟切片，進行常規(guī)HE染色，光鏡下盲法檢查，參照文獻方法，根據(jù)結(jié)腸組織潰瘍程度、深度、水腫、炎癥細胞浸潤及程度評價組織病理學變化［8］。

1.2.5 實時定量PCR檢測小鼠結(jié)腸組織中TLR4及NF-κBp65 mRNA水平RNA試劑盒提取小鼠結(jié)腸組織（每組取6只小鼠）RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時PCR進行TLR4及NF-κBp65 mRNA表達量的檢測。以GAPDH為內(nèi)參，各基因相對表達量按照2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR檢測的基因引物序列Tab.1 Sequence of gene primers for RT-qPCR detection

1.2.6 免疫組化檢測小鼠結(jié)腸組織TLR4及NFκBp65水平 小鼠石蠟切片經(jīng)雙氧水封閉、熱原修復、5%胎牛血清封閉，滴加TLR4及NF-κBp65一抗（1：200），4℃過夜。次日PBS洗滌3次，使用1：100倍稀釋的山羊抗兔IgG在37℃恒溫烘箱中孵育15 min，PBS液洗滌，室溫DAB顯色，顯微鏡下觀察。參照文獻方法，根據(jù)染色強度及陽性面積計算各蛋白表達積分［9］。

1.2.7 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織TLR4及NFκBp65蛋白水平 取加入蛋白酶及磷酸化酶抑制劑的小鼠結(jié)腸組織勻漿液，12 000 r∕min，4℃離心10 min，水浴加熱變性后測定蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣，電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后，依次使用1：1 000稀釋的TLR4、NF-κBp65及GAPDH抗體及1：2 000稀釋的山羊抗兔IgG抗體孵育，PBST清洗后，滴加顯影劑在凝膠成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用Image J軟件進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析利用SPSS20.0軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，兩兩比較則采用LSD檢驗，作圖使用Graphpad prism 8.0完成，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AP對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI的影響 模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI較對照組顯著升高（P＜0.05），提示造模成功；與模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠DAI顯著降低（P＜0.05，表2）。

表2 各組小鼠的DAI指數(shù)（±s，n=15）Tab.2 DAI water of mice in different groups（±s，n=15）

表2 各組小鼠的DAI指數(shù)（±s，n=15）Tab.2 DAI water of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive DAI 0.00±0.00 2.63±0.171）1.11±0.112）0.93±0.062）0.86±0.042）0.90±0.072）

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學檢查 對照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理學變化；與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜不完整，出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，上皮及隱窩被破壞，腸壁增厚，病理學評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織病理學恢復，黏膜腺體排列較整齊，腸壁基本恢復，肌層病變明顯減輕，炎癥浸潤減輕，病理學評分明顯降低（P＜0.05，圖1、2）。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學檢查結(jié)果（HE，×200）Fig.1 Histopathological examination of colon in different groups of mice（HE，×200）

2.3 AP對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素及TGF-β1水平的影響 模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α、IL-6水平較對照組顯著升高（P＜0.05），而脂聯(lián)素及TGF-β1水平較對照組則顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），脂聯(lián)素及TGF-β1水平顯著升高（P＜0.05，表3）。

表3 各組小鼠的TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素及TGF-β1水平（±s，n=15）Tab.3 Levels of serum TNF-α，IL-6，TGF-β1 and Adipo?nectin in different groups of mice（±s，n=15）

表3 各組小鼠的TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素及TGF-β1水平（±s，n=15）Tab.3 Levels of serum TNF-α，IL-6，TGF-β1 and Adipo?nectin in different groups of mice（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive TNF-α（pg∕ml）15.37±0.51 77.92±2.451）42.68±1.442）37.65±2.132）18.10±1.492）17.41±1.512）IL-6（pg∕ml）24.60±1.72 174.88±2.571）53.86±1.952）43.67±1.882）29.77±1.222）27.24±1.892）Adiponectin（μg∕ml）7.76±0.14 5.13±0.071）6.34±0.032）6.91±0.042）7.53±0.062）7.28±0.082）TGF-β1（pg∕ml）567.13±36.16 198.71±21.641）263.43±29.612）319.97±37.472）406.73±21.442）484.74±27.172）

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織P-選擇素、MIF及TXB2水平的比較 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織P-選擇素、MIF及TXB2水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織P-選擇素、MIF及TXB2水平顯著降低（P＜0.05，表4）。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織的P-選擇素、MIF及TXB2水平（±s，n=15）Tab.4 Levels of P-selectin，MIF and TXB2 in colonic tis?sue of mice in different groups（±s，n=15）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織的P-選擇素、MIF及TXB2水平（±s，n=15）Tab.4 Levels of P-selectin，MIF and TXB2 in colonic tis?sue of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive P-selectin（μg∕L）297.68±73.16 864.71±89.411）537.14±48.582）383.66±74.802）313.64±43.712）289.27±52.692）MIF（ng∕L）1968.59±144.82 6311.05±327.121）5038.13±348.512）4374.80±377.072）3873.07±263.272）2109.30±300.062）TXB2（mg∕L）81.96±3.27 265.31±2.641）195.04±2.072）137.18±3.072）108.73±2.772）91.39±3.572）

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織SOD、MPO、MDA水平的比較 模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織SOD活性較對照組顯著降低（P＜0.05），MPO活性及MDA水平較對照組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織SOD活性顯著升高（P＜0.05），MPO活性及MDA水平顯著降低（P＜0.05，表5）。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織的SOD、MPO、MDA水平（±s，n=15）Tab.5 SOD，MPO and MDA level in colonic tissue of mice in different groups（±s，n=15）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織的SOD、MPO、MDA水平（±s，n=15）Tab.5 SOD，MPO and MDA level in colonic tissue of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive SOD（U∕mgprot）84.35±1.59 34.40±2.921）47.82±1.992）58.72±2.612）69.44±1.402）78.84±2.072）MDA（nmol∕mgprot）0.76±0.04 4.42±0.191）2.35±0.072）1.51±0.092）0.87±0.062）0.83±0.072）MPO（U∕mgprot）0.63±0.08 3.41±0.131）1.51±0.052）1.21±0.072）1.07±0.092）0.96±0.042）

圖2 大鼠結(jié)腸組織病理學評分Fig.2 Histopathological score of colon in rats

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4及NF-κBp65 mRNA水平比較 模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織TLR4及NF-κBp65 mRNA水平較對照組小鼠顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織TLR4及NF-κBp65 mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織的TLR4及NF-κBp65 mRNA水平Fig.3 Levels of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in colonic tissue of mice in each group

2.7 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65免疫組化表達評分比較 模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65免疫組化表達評分較對照組顯著升高（P＜0.05），且TLR4主要在細胞膜表達，NFκBp65主要在細胞核表達；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65免疫組化表達評分顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織的TLR4、NF-κBp65免疫組化表達評分Fig.4 Immunohistochemical expression score of TLR4 and NF-κBp65 in colonic tissue of mice in each group

2.8 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65水平比較 見圖5，模型組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65蛋白水平較對照組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，AP各劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織的TLR4、NF-κBp65水平Fig.5 Levels of TLR4 and NF-κBp65 in colonic tissue of mice in each group

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)，以結(jié)腸及直腸慢性非特異性炎癥性為病理特征的疾病，患者常出現(xiàn)排膿血便及黏液便，并伴有陣發(fā)性結(jié)腸痙攣性疼痛，其發(fā)病機制及病因目前尚不明確，普遍認為其發(fā)病是外源物質(zhì)引起宿主反應(yīng)、基因和免疫三者相互作用的結(jié)果［10］。中醫(yī)理論認為，脾胃虛弱為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病之本，濁毒內(nèi)蘊為發(fā)病之標，飲食不節(jié)制及情志不調(diào)為誘發(fā)因素，進而引發(fā)大腸濕熱，腑氣壅滯，氣滯血阻，腸絡(luò)受損。在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)作期，患者體內(nèi)濁毒盛行，脾胃失調(diào)，運化失權(quán)導致水濕泛濫，濁而不化，郁結(jié)不散，下結(jié)于腸腑。氣血于腸腑停滯，淤而不通，導致血肉腐敗，釀化為膿。病情緩解時，患者體內(nèi)濁毒雖有減弱之勢，但仍潛伏于體內(nèi)，如遇濁毒內(nèi)邪浮動，濁毒再次累及腸絡(luò)，癰瘍繼而再次形成，因此表現(xiàn)出時發(fā)時止的特征。中醫(yī)理論認為潰瘍性結(jié)腸炎久治不愈，反復難愈的根結(jié)在于腸內(nèi)濁毒形成引起陽氣難以通達，傷津耗液并累及多臟。本實驗選用柳氮磺吡啶作為陽性對照組藥物。柳氮磺吡啶是目前臨床上用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥物之一，但其在臨床使用中易出現(xiàn)藥疹、剝脫性皮炎、中性粒細胞缺乏等多種不良反應(yīng)，所以對于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的研發(fā)仍是目前的工作重點之一。

黃芪來源于豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪（As?tragalus propinquus Schischkin）的干燥根。黃芪古稱黃耆，所謂“耆”，是眾多中藥材里面的補藥之長。其色黃入脾，所以自古以來黃芪廣泛應(yīng)用于眾多補脾補氣的中藥方劑中，具有益氣固表、補氣升陽、生津養(yǎng)血等補益的功用。AP是從中藥材黃芪中提取分離得到的水溶性雜多糖，研究表明其對糖尿病腎病、膿毒癥、視網(wǎng)膜病變、軟骨細胞損傷、腫瘤等多種疾病都具有一定的改善及治療作用［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)AP對潰瘍性結(jié)腸炎也具有顯著的改善作用，其中，郭艷等［11］研究表明AP能夠調(diào)節(jié)Th17相關(guān)細胞因子，減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)；奚沁華等［12］也報道了AP能夠修復潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的腸道黏膜，改善小鼠的疾病轉(zhuǎn)歸及預后。

TGF-β1是一種抗炎癥性細胞因子，能夠下調(diào)過度的免疫反應(yīng)而抑制炎癥的發(fā)生，并促進上皮細胞的修復［13］；TNF-α、IL-6是反映體內(nèi)炎癥水平的重要指標，其水平的升高提示炎癥進展或加?。?4］；SOD活性及MDA水平的升高提示機體存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷，且機體的自我修復能力下降［15］；MPO是中性粒細胞分泌的一種酶，其水平的升高可促進炎癥效應(yīng)細胞的增殖與活化，加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)［16］；P-選擇素、MIF及TXB2均是與炎癥相關(guān)的細胞因子，其水平的升高，能夠抑制巨噬細胞游走，促進巨噬細胞在炎癥部位聚集，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)［17］。本文研究結(jié)果表明，與模型組比較，AP能夠顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α、IL-6水平，抑制結(jié)腸組織MPO活性、MDA、P-選擇素、MIF及TXB2水平，并且血清TGF-β1水平及結(jié)腸組織SOD活性增加，緩解小鼠體內(nèi)的炎癥狀態(tài)。

脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽，研究發(fā)現(xiàn)［18］脂聯(lián)素具有抗糖尿病、抗動脈粥樣和炎癥的潛力，其在炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機制及疾病進展中，與體內(nèi)炎癥因子水平及炎癥細胞數(shù)呈負相關(guān)。臨床研究顯示，脂聯(lián)素與潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)炎癥因子水平密切相關(guān)，并能夠反映患者的疾病程度，影響疾病轉(zhuǎn)歸，并影響體內(nèi)TLR∕NFκB信號通路相關(guān)蛋白的表達［19］。TLR∕NF-κB信號通路普遍存在于真核細胞中與免疫及炎癥信號傳遞及表達密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路［20］。已有研究［21］證實其在潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中異常表達，抑制TLR∕NF-κB信號通路的激活能夠改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)，促進結(jié)腸黏膜的恢復。結(jié)果表明，AP能夠降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65水平，升高脂聯(lián)素水平，改善小鼠結(jié)腸組織病理學變化，這表明AP可能通過調(diào)節(jié)脂聯(lián)素∕TLR∕NF-κB信號通路，進而抑制小鼠體內(nèi)炎癥因子釋放，抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，并通過激活體內(nèi)TGF-β1及SOD等抗氧化損傷的自我修復系統(tǒng)，促進機體自我恢復，進而發(fā)揮其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。

綜上所述，AP能夠顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎癥水平及組織氧化應(yīng)激損傷，促進結(jié)腸組織病理學恢復，其機制可能與調(diào)節(jié)脂聯(lián)素∕TLR∕NFκB信號通路有關(guān)。