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    骨關(guān)節(jié)炎患者免疫炎癥關(guān)鍵蛋白表達譜變化及中醫(yī)藥的干預(yù)研究①

    2021-08-21 04:36:20鮑丙溪孫廣瀚
    中國免疫學(xué)雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:新風(fēng)關(guān)聯(lián)膠囊

    鮑丙溪 劉 健 萬 磊 黃 旦 張 穎 龍 琰 孫廣瀚

    (安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥230031)

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是關(guān)節(jié)疾病中較常見的,全球約有2.5億人,占所有關(guān)節(jié)疾病的40%左右[1-2]。近年來,骨關(guān)節(jié)炎的患病率和負(fù)擔(dān)大大增加,生活水平的提高、人口老年化和肥胖人口的增加也成為發(fā)病率增高的因素[3-4]。

    關(guān)節(jié)軟骨的破壞是OA最顯著的特征,包括滑膜、Ⅱ型膠原、聚集蛋白多糖、軟骨下骨和關(guān)節(jié)周圍軟組織的破壞,并伴有關(guān)節(jié)功能障礙[5-6]。骨關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、僵硬,嚴(yán)重活動性腫脹,甚至不能活動[7]。除了關(guān)注疾病,我們還需要關(guān)注與疾病相關(guān)的生理、心理和社會互動。與其他慢性疾病相比,OA患者的歲數(shù)相對較低。OA不僅給患者帶來疼痛,而且對其自身的社會交往也有很大影響,造成負(fù)面情緒,導(dǎo)致患者感受降低[8]。

    本研究采用Raybiotech抗體芯片檢測OA患者體內(nèi)與免疫炎癥相關(guān)蛋白的變化情況,應(yīng)用ELISA進行驗證,并探究中醫(yī)藥對OA患者變化的差異蛋白及實驗室指標(biāo)的影響,探究其改善OA的作用機制。

    1 資料與方法

    1.1 資料 收集10例OA患者和10例健康人,利用蛋白芯片進行關(guān)鍵蛋白篩選。30例OA治療前后患者和30例健康人,利用ELISA進行關(guān)鍵蛋白驗證,所有實驗組檢測樣本均來自2018年12月至2019年2月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科住院患者,健康對照組來自醫(yī)院健康體檢中心。兩組數(shù)據(jù)在年齡、性別上無差異。本研究獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審查號:2014AH-06),患者知情且簽署同意書。①診斷標(biāo)準(zhǔn):西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照1995年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]及2007年中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南[10]。②排除標(biāo)準(zhǔn):排除合并其他風(fēng)濕性疾病,排除嚴(yán)重原發(fā)性心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、妊娠期及哺乳期婦女、患有精神疾病無法配合的患者。

    1.2 方法

    1.2.1 實驗分組 實驗組:新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥飲片口服(新風(fēng)膠囊:由薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤組成,安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑,皖藥制Z20050062,規(guī)格:0.34 g∕粒,3粒∕次,3次∕d;中藥湯劑內(nèi)服,1劑∕d,早晚分服),對照組:僅內(nèi)服中藥湯劑,1劑∕d。

    1.2.2 數(shù)據(jù)分析

    1.2.2.1 OA患者免疫炎癥差異蛋白篩選 芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Raybiotech軟件進行芯片背景去除、芯片間歸一化處理。然后選擇Result數(shù)據(jù)來做分析。兩組間比較分析方法為moderated t-statistics,數(shù)據(jù)包為limma,來自R∕Bioconductor;采用adjustPvalue(或Pvalue)和logFC(表達差異倍數(shù),以2為底)對差異蛋白進行篩選;3組比較分析方法為One-way ANOVA,數(shù)據(jù)包為stats。

    1.2.2.2 生物信息學(xué)分析 主成分分析(PCA)和基因本體分析(GO)分別鑒定了差異表達蛋白及其功能。京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析差異表達蛋白具有的主要生物學(xué)功能及其參與的主要生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。層次聚類分析差異蛋白表達模式。PCA數(shù)據(jù)包“ggfortify”、GO及KEGG富集分析數(shù)據(jù)包“clusterProfiler”、層次聚類分析數(shù)據(jù)包“gplots”。

    1.2.2.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 關(guān)聯(lián)規(guī)則中將治療后指標(biāo)改善設(shè)為T,反之為F,前項為中藥或新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥,后項為關(guān)鍵蛋白和免疫炎癥實驗室指標(biāo)。設(shè)定最小支持度及置信度,若生成的關(guān)聯(lián)規(guī)則中所有數(shù)據(jù)大于最小設(shè)定值,則被稱為強關(guān)聯(lián)規(guī)則[11],計算公式如下[12]:

    1.2.2.4 觀察指標(biāo) 關(guān)鍵蛋白:B7-1、ICOS、PD-L2;免疫炎癥指標(biāo):免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體C3、補體C4、血沉(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP);患者感受相關(guān)指標(biāo):患者焦慮量表(SAS)、患者抑郁量表(SDS)、SF-36量表(生理機能PF、生理職能RP、軀體疼痛BP、一般健康GH、精力VT、社會功能SF、情感職能RE、精神健康MH)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料以±s表示,計數(shù)資料以率表示,治療前后應(yīng)用配對t檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 蛋白芯片篩選OA免疫炎癥相關(guān)蛋白 選取OA組10例,男1例,女9例,平均年齡(59.8±9.5)歲;對照組10例,女8例,男2例,平均年齡(58.0±9.3)歲,兩組年齡、性別基線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ELISA驗證OA免疫炎癥相關(guān)蛋白,選取OA患者治療前及治療后30例,女24例,男6例,平均年齡(60.6±10.6)歲;對照組30例,女性26例,男性4例,平均年齡(55.3±8.9)歲,兩組年齡、性別基線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 抗體芯片檢測OA患者血清蛋白表達譜

    2.2.1 OA潛在生物標(biāo)志物的鑒定 通過火山圖(圖1A)和散點圖(圖1B)對OA組蛋白與Control組蛋白進行比較,結(jié)果表明,OA組血清蛋白表達與Control組有顯著差異。其中OA組3個蛋白較Control組有顯著變化,OA組B7-1、ICOS、PD-L2均下調(diào)。

    2.2.2 OA患者血清蛋白表達譜 圖1A火山圖表示有3個差異蛋白表達;圖1B中藍(lán)色表示下調(diào)蛋白,紅色表示上調(diào)蛋白;圖1C中紅色表示對照組,藍(lán)色表示OA患者,其中各樣本前兩個主成分(PC1和PC2)顯示,總變異率為84.05%和15.03%(圖1C),提示OA患者與對照組的蛋白表達模式存在差異;圖1D為差異蛋白熱圖,將樣本分為4個主要類群,第一類群包括3例OA患者和6例對照組,第二類群包括3例OA患者和1例對照組,第三類群僅包括3例OA患者,第四類群包括1例OA患者和3例對照組。

    圖1 OA患者和對照組蛋白表達譜Fig.1 Protein expression profiles of OA patients and con?trols

    2.2.3 生物信息學(xué)分析 通過GO富集分析顯示,有顯著功能項25個,其中BP功能項20個(圖2A),MF功能項3個(圖2B),CC功能項2個(圖2C)。KEGG富集分析顯示,DEPs在12個途徑中顯著富集(圖2D)。以上富集的信息和信號通路可能反映了OA的發(fā)病機制。

    圖2 OA生物信息學(xué)分析Fig.2 OA bioinformatics analysis

    2.3 關(guān)鍵蛋白驗證 選取30例治療前后OA患者,通過ELISA對芯片篩選出的3個與OA免疫驗證相關(guān)的蛋白進行驗證,結(jié)果顯示,OA組與對照組相比較,B7-1、ICOS、PD-L2(圖3)3個蛋白顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖3 ELISA驗證差異蛋白變化Fig.3 Changes of DEPs were verified by ELISA

    2.4 OA患者治療前關(guān)鍵蛋白與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 利用Spearman相關(guān)性檢驗,結(jié)果顯示ICOS與ESR、CRP、補體C3、補體C4及BP呈顯著負(fù)相關(guān),B7-1與SAS呈顯著正相關(guān)(圖4)。

    圖4 關(guān)鍵蛋白與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of key proteins and related indexes

    2.5 OA患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況 選取30例治療前后OA患者,比較OA患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況,結(jié)果顯示OA患者治療后B7-1、ICOS和PD-L2(P<0.01),ESR、補體C4、SAS和BP(P<0.05)均有明顯改善,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

    圖5 OA患者治療前后蛋白及相關(guān)指標(biāo)變化情況Fig.5 Changes of protein and related indexes in OA patients before and after treatment

    2.6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)改善情況 選取30例治療后OA患者,其中對照組19例,實驗組11例,比較對照組和實驗組患者治療后相關(guān)指標(biāo)情況,結(jié)果顯示實驗組治療后患者的CRP和IgA的改善情況相比對照組(圖6),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關(guān)指標(biāo)變化情況Fig.6 Changes of DEPs and related indexes before and after treatment in two groups

    2.7 中藥與患者實驗室指標(biāo)及其他相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 選取30例OA患者,調(diào)取患者使用中藥情況,設(shè)定前項為單味中藥,設(shè)定后項為免疫炎癥相關(guān)差異蛋白和免疫炎癥實驗室指標(biāo),設(shè)置最小支持度為50%,最低置信度為90%,經(jīng)Aprior模塊分析,差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強關(guān)聯(lián);ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強關(guān)聯(lián);PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強關(guān)聯(lián),以上結(jié)果支持度均>50%,置信度>90%,提升>1,見表1。

    表1 對照組與差異蛋白的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.1 Analy association rules between control group and related indexes

    設(shè)定前項為新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥,設(shè)定后項為免疫炎癥相關(guān)差異蛋白和免疫炎癥實驗室指標(biāo),設(shè)置最小支持度為30%,最低置信度為70%,經(jīng)Aprior模塊分析,IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PDL2的上升均與新風(fēng)膠囊聯(lián)合山藥有強關(guān)聯(lián),以上結(jié)果支持度均>30%,置信度>70,提升>1,見表2。

    表2 實驗組與差異蛋白及免疫炎癥實驗室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.2 Association rule analysis of experimental group and relevant laboratory indexes

    3 討論

    OA是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病,以慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨變性和軟骨下骨重塑為特征[13]。紅細(xì)胞沉降率(ESR)和c反應(yīng)蛋白(CRP)是顯著反映炎癥變化的指標(biāo)。ESR和CRP濃度是診斷膝關(guān)節(jié)疼痛(包括并發(fā)癥)的重要診斷方法。另外補體系統(tǒng)是先天免疫的重要組成部分,在OA患者滑膜和滑膜組織中可以檢測到[14]。修復(fù)軟骨紊亂引起的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的釋放以及軟骨細(xì)胞凋亡特征的改變所致的病理變化,與激活補體系統(tǒng)有一定的關(guān)聯(lián),能顯著增強OA的病理反應(yīng)[15]。

    ICOS是CD28家族的一員。ICOS信號在維持T淋巴細(xì)胞效應(yīng)和記憶細(xì)胞活化、免疫球蛋白轉(zhuǎn)換、調(diào)節(jié)Th細(xì)胞極化等方面發(fā)揮重要作用[16]。ICOS及其特異性配體(ICOSL)有激活誘導(dǎo)和調(diào)控免疫應(yīng)答的特征,推測ICOS∕ICOSL信號可能參與OA的發(fā)生發(fā)展,從而參與調(diào)節(jié)OA的免疫損傷和免疫紊亂[17]。B7-1蛋白表達于抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面,在固有免疫系統(tǒng)中的作用是在免疫激活和免疫抑制之間建立平衡關(guān)系。B7-1及其受體,包括CD28、CTLA4和PD-L1,對機體的穩(wěn)定起著調(diào)節(jié)控制作用[18]。PDL2是B7-DC家族成員,是抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要調(diào)控分子,參與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機制[19]。關(guān)于B7-1和PD-L2在骨關(guān)節(jié)炎中的作用,相關(guān)文獻較少,尚需進行大量的臨床研究或者動物實驗研究。

    本研究使用蛋白芯片來分析OA患者和對照組血清中關(guān)鍵免疫炎癥蛋白的表達,獲得3個差異蛋白并進行相關(guān)蛋白分析(GO、KEGG pathway、PCA),以了解OA新的發(fā)病機制。GO和KEGG富集分析表明,免疫炎癥的關(guān)鍵蛋白在OA的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。蛋白芯片篩選結(jié)果顯示,與OA相關(guān)的關(guān)鍵蛋白為ICOS、B7-1和PD-L2,經(jīng)ELISA驗證,其表達較對照組下調(diào)(P<0.01)。中醫(yī)治療OA以安全、費用低、患者痛苦小,可以改善患者關(guān)節(jié)功能及生活質(zhì)量而更容易被患者所接受。本次研究結(jié)果顯示:通過相關(guān)性分析,ICOS與ESR、CRP、補體C3、補體C4及BP呈顯著負(fù)相關(guān),B7-1與SAS呈顯著正相關(guān),與臨床實際相符合;OA患者治療后B7-1、ICOS、PD-L2、ESR、補體C4、SAS和BP均有明顯改善(P<0.05);比較單純中藥組和中藥聯(lián)合新風(fēng)膠囊組患者治療后相關(guān)指標(biāo)情況,結(jié)果顯示使用中藥聯(lián)合新風(fēng)膠囊治療后患者的CRP和IgA的情況較使用單純中藥治療后改善較好;通過中藥與相關(guān)指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,結(jié)果顯示差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強關(guān)聯(lián);ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強關(guān)聯(lián);PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強關(guān)聯(lián),IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PD-L2的上升均與新風(fēng)膠囊聯(lián)合山藥有強關(guān)聯(lián)。研究表明陳皮、蒲公英、丹參、桃仁和山藥等有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫的作用[20-24],對調(diào)節(jié)差異蛋白有著重要作用;新風(fēng)膠囊是延續(xù)新安從脾治痹思想的基礎(chǔ)上研制的中成藥[25-27],通過關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可知新風(fēng)膠囊與山藥聯(lián)合使用可以對免疫炎癥指標(biāo)及關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)有重要的作用,這與新風(fēng)膠囊的藥物組成可能有密切聯(lián)系。新風(fēng)膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成。組方中各藥都具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛的效果。黃芪、薏苡仁有益氣健脾作用,能夠調(diào)節(jié)雷公藤的毒副作用造成患者免疫力低下的不良反應(yīng)?,F(xiàn)代藥理研究證明,黃芪能增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量以及提高其吞噬能力[28]。雷公藤具有祛風(fēng)濕、活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用,能抗炎鎮(zhèn)痛、抑制白介素等細(xì)胞因子的表達,從而達到良好的治療效果[29]。文建庭等[30]通過數(shù)據(jù)挖掘的方法研究新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥與單純中藥治療OA療效差別,研究顯示經(jīng)過隨機行走模型的分析,新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥在降低OA患者ESR和hs-CRP的效果優(yōu)于單純中藥組;汪元等[31]觀察中藥內(nèi)服外敷對OA的療效,發(fā)現(xiàn)新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥內(nèi)服與外敷在改善ESR、ALP、PLT、SOD等方面優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組,對患者的生活質(zhì)量也有一定的改善;談冰等[32]研究也發(fā)現(xiàn)新風(fēng)膠囊治療OA患者,在降低P65、TRAF、IL-17、hs-CRP、ESR,升高IL-4方面明顯優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組。新風(fēng)膠囊在臨床應(yīng)用數(shù)年,在治療骨關(guān)節(jié)炎上療效顯著。

    應(yīng)用蛋白芯片檢測OA患者血清中與免疫炎癥相關(guān)的蛋白表達情況,進一步明確RA的發(fā)病機理,發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物。從上述研究可知,中醫(yī)藥對改善骨關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵蛋白的表達有重要的作用,尤其是新風(fēng)膠囊聯(lián)合中藥不僅在改善關(guān)鍵蛋白上有明顯作用,在對免疫炎癥實驗室指標(biāo)的改善上同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。由于骨關(guān)節(jié)炎的蛋白表達研究相對較少,其機制還需進一步研究驗證。

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