標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)健康人外周血淋巴細(xì)胞亞群分析的影響

陽(yáng) 莉 陳曉燕 蔡惠寧 陳偉材 盧建溪（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣州510630）

外周血淋巴細(xì)胞是維持機(jī)體免疫功能的主要細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等，這些細(xì)胞又可分成不同亞群［1-2］。采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，可以監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)健康人群免疫功能，也能評(píng)估腫瘤患者、自身免疫性疾病和亞健康人群的免疫狀態(tài)，對(duì)疾病的診斷分期、預(yù)后評(píng)估、療效評(píng)價(jià)等均有重要指導(dǎo)意義［3-7］。

流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞亞群是臨床醫(yī)學(xué)常用的檢查項(xiàng)目，在檢測(cè)外周血時(shí)一般使用新鮮樣本進(jìn)行檢測(cè)以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但由于流式細(xì)胞儀儀器維護(hù)成本高，每次開(kāi)機(jī)都要增加質(zhì)控微球、清洗液等試劑成本，在檢測(cè)量小的情況下，浪費(fèi)人力、物力。因此，如何減少人力消耗、降低試劑和儀器維護(hù)成本，成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。有研究關(guān)注艾滋病、腫瘤、原發(fā)性失眠、結(jié)核等疾病患者淋巴細(xì)胞亞群的變化，但對(duì)標(biāo)本保存時(shí)間和溫度對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果影響的研究較少。本文針對(duì)健康人群標(biāo)本進(jìn)行了樣本保存時(shí)間及溫度對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群影響的研究，為流式樣本的保存時(shí)間提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本來(lái)源 采集的外周血均來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院，共23例，其中男性10例，女性13例；年齡21～74歲，中位年齡33歲，平均年齡（39.09±15.36）歲。

1.1.2主要儀器與試劑 采血管為BD真空采血管，內(nèi)含肝素鋰抗凝劑。PBS（美國(guó)Gibco公司）；人淋巴細(xì)胞分離液（挪威Axis-shield公司）；溶血?jiǎng)?、淋巴?xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3、淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD8/CD4/CD3、CytoFLEXDaily質(zhì)控微球（美國(guó)Beckman Coulter公司）。Cyto-FLEX流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Centrifuge 5810R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 采集空腹抗凝全血5 ml，立即送至實(shí)驗(yàn)室分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將抗凝全血以PBS稀釋混勻，緩緩加入帶有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，800 g離心20 min，提取白膜層細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)。按分組用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，或置于4℃繼續(xù)保存。

1.2.2 樣本的預(yù)處理23份樣本分離后的外周血單個(gè)核細(xì)胞分為立即檢測(cè)（D0組）、4℃保存1 d（D1組）、4℃保存2 d（D2組）、4℃保存3 d（D3組）和4℃保存5 d（D5組）共5組，每組取2×106個(gè)細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 每次檢測(cè)前，用Cyto-FLEX流式細(xì)胞分析儀配套的CytoFLEXDaily質(zhì)控微球進(jìn)行儀器性能狀態(tài)檢測(cè)和校正，合格后方能使用。每組樣本按淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3和淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD8/CD4/CD3實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行染色后，上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件處理和分析數(shù)據(jù)。重復(fù)測(cè)量資料多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞物理參數(shù)變化情況D0、D1、D2、D3和D5組細(xì)胞的物理參數(shù)變化如下：5組細(xì)胞在FSC/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖中的位置均未發(fā)生變化；在CD45-FITC/SSC-A雙參數(shù)散點(diǎn)圖中，D0、D1、D2和D3組淋巴細(xì)胞分群明顯，而D5組淋巴細(xì)胞分群不明顯且位置發(fā)生較大偏移（圖1）?？梢?jiàn)，樣本處理4 d內(nèi)上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞物理參數(shù)沒(méi)有明顯變化。

圖1 不同保存時(shí)間淋巴細(xì)胞物理參數(shù)變化Fig.1 Changes of physical parameters of lymphocyte in different storage times

2.2 淋巴細(xì)胞亞群變化情況D0、D1、D2、D3和D5組淋巴細(xì)胞亞群比例結(jié)果如圖2、表1所示。各組分別與D0組進(jìn)行比較，總T細(xì)胞比例D5組比D0組明顯降低（P＜0.05），NKT細(xì)胞比例D3組和D5組均比D0組明顯降低（P＜0.05），B細(xì)胞比例D3組和D5組均比D0組明顯升高（P＜0.05），Th、Ts、CD4+/CD8+T、NK細(xì)胞比例各組與D0組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同保存時(shí)間淋巴細(xì)胞亞群比例變化Fig.2 Changes of percentage of lymphocyte subsets in different storage times

表1 不同保存時(shí)間淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)結(jié)果（±s，n=23，%）Tab.1 Data of lymphocyte subsets classifications for different storage times（±s，n=23，%）

表1 不同保存時(shí)間淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)結(jié)果（±s，n=23，%）Tab.1 Data of lymphocyte subsets classifications for different storage times（±s，n=23，%）

Note：1）P＜0.05，compared with D0 group.

Lymphocyte subsets T（CD3+）Th（CD3+CD4+）Ts（CD3+CD8+）CD4+/CD8+B（CD3-CD19+）NK（CD3-CD56+）NKT（CD3+CD56+）D0 64.01±2.03 29.19±2.09 25.98±1.63 1.36±0.18 8.45±0.94 21.89±2.03 10.28±1.18 D1 65.36±2.60 32.60±2.21 26.26±1.80 1.21±0.17 7.91±0.96 19.29±1.76 9.63±1.20 D2 58.20±3.02 26.16±1.93 24.45±1.62 1.21±0.13 9.76±1.06 25.15±3.22 8.88±1.27 D3 62.57±3.46 25.71±1.93 25.79±1.80 1.24±0.18 11.33±1.051）22.01±3.08 7.08±1.151）D5 52.52±3.811）23.12±2.27 22.58±2.19 1.57±0.29 15.50±1.691）17.45±2.79 6.66±1.211）

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)目前廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，用于建立淋巴細(xì)胞參考值范圍、評(píng)估機(jī)體免疫功能及疾病診斷治療等各個(gè)方面［8-10］。使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)表面分子進(jìn)行檢測(cè)，已成為免疫調(diào)控研究及評(píng)價(jià)中常規(guī)而重要的指標(biāo)。淋巴細(xì)胞根據(jù)表面標(biāo)志的不同分為T(mén)淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等，而T淋巴細(xì)胞分為輔助和殺傷細(xì)胞亞群，在細(xì)菌和病毒感染、免疫缺陷病、腫瘤、原發(fā)性失眠或其他免疫性疾病等疾病的過(guò)程中淋巴細(xì)胞亞群都會(huì)發(fā)生變化［11-14］。流式細(xì)胞術(shù)被認(rèn)為是淋巴細(xì)胞免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以比較細(xì)胞的大小和細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度，F(xiàn)SC/SSC值越大說(shuō)明細(xì)胞體積越大和顆粒越多。不同抗凝劑、標(biāo)本的保存時(shí)間和溫度、樣本制備方法等因素均可對(duì)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果產(chǎn)生影響［15］，從而需要實(shí)驗(yàn)室建立涉及從標(biāo)本采集到上機(jī)檢測(cè)整個(gè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定的實(shí)施方案。

本研究在確定電壓和熒光補(bǔ)償?shù)葯z測(cè)條件后，在固定的檢測(cè)方案下，對(duì)立即檢測(cè)、4℃保存1 d、4℃保存2 d、4℃保存3 d和4℃保存5 d的樣本分別進(jìn)行檢測(cè)，分析物理參數(shù)和細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化情況。CD45分子為白細(xì)胞共同抗原，可作為淋巴細(xì)胞的分類(lèi)標(biāo)志，本研究用FSC/SSC和CD45/SSC雙參數(shù)分析，CD45/SSC可避免樣本中殘存的其他血細(xì)胞對(duì)分析的影響，淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分群更明顯。結(jié)果發(fā)現(xiàn)立即檢測(cè)、4℃保存1 d、2 d、3 d和5 d的細(xì)胞在FSC/SSC散點(diǎn)圖中的位置基本沒(méi)有變化；保持Lym設(shè)門(mén)位置不變，發(fā)現(xiàn)立即檢測(cè)、4℃保存1 d、2 d和3 d的細(xì)胞在CD45/SSC散點(diǎn)圖中的位置基本沒(méi)有變化，而4℃保存5 d的細(xì)胞位置向左和向下偏移且分群不明顯?？梢?jiàn)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞物理和化學(xué)參數(shù)都發(fā)生變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，CD3、CD4、CD8、CD56等標(biāo)記分子出現(xiàn)不同程度的熒光強(qiáng)度的減弱，可能是因?yàn)闃?biāo)本長(zhǎng)期保存對(duì)表面抗原造成破壞。

綜上所述，對(duì)進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群分析的標(biāo)本，在收到后立刻處理，用PBS于4℃條件保存3 d內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)結(jié)果比較穩(wěn)定。因此，對(duì)于標(biāo)本量少的實(shí)驗(yàn)室，可集中標(biāo)本每3d開(kāi)機(jī)檢測(cè)，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，節(jié)約人力和成本。