lncRNA FAM83H-AS1通過抑制miR-383-3p表達調(diào)控食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的分子機制研究①

李昱霖 謝 琳 鄧明佳 李 楊 易子寒

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科，昆明650000）

食管癌是我國發(fā)病率較的惡性腫瘤之一，其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已屬中晚期，喪失了最佳手術(shù)治療時機，且部分患者對放化療不敏感，預(yù)后較差；隨著精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療成為腫瘤治療的一個重要發(fā)展方向［1］。研究表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等過程，在其中發(fā)揮了 關(guān) 鍵 作 用［2］。研 究 報 道lncRNA FAM83H反 義RNA 1（FAM83H antisense RNA 1，lncRNA FAM83HAS1）在胃癌中異常上調(diào)表達，在胃癌中起癌基因的作用［3］。lncRNA FAM83H-AS1可促進肺腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲并顯著抑制細胞凋亡［4］。上調(diào)lncRNA FAM83H-AS1通過Wnt/β-catenin途徑可促進肝細胞癌細胞增殖，遷移和侵襲［5］。miR-383-3p通過靶向MACC1抑制人惡性黑色素瘤中的細胞增殖，遷移和侵襲［6］。過表達miR-383通過下調(diào)5S rRNA的表達抑制了食管鱗癌細胞的增殖［7］。然而lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制目前還尚未可知。本實驗旨在研究FAM83H-AS1是否通過調(diào)控miR-383-3p影響食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床組織標(biāo)本來源 選取本院2017年1月至2019年1月收治并經(jīng)病理學(xué)檢驗為食管癌的患者35例。所有患者均具有完整臨床病理資料，手術(shù)前未進行過手術(shù)及放化療，經(jīng)手術(shù)切除患者癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的作為癌旁組織，所有患者均知情且同意。

1.1.2 細胞及主要試劑與儀器 食管癌細胞株EC9706購自上?？道噬锟萍加邢薰?；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自廈門慧嘉生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。CO2孵育箱、Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 食管癌細胞EC9706用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞，將si-NC、si-FAM83H-AS1、pcDNA、pcDNA-FAM83H-AS1、miR-NC、miR-383-3p轉(zhuǎn)染至EC9706細胞中，記為si-NC組、si-FAM83H-AS1組、pcDNA組、pcDNAFAM83H-AS1組、miR-NC組、miR-383-3p組；將si-FAM83H-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-383-3p共轉(zhuǎn)染至EC9706細胞中，記為si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC組、si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p組。

1.2.2 RT-qPCR檢 測FAM83H-AS1和miR-383-3p的表達水平 各組細胞培養(yǎng)24 h，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，循環(huán)條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；60℃延 長5 min。相 對 表 達 量 用2-ΔΔCt法 計 算。FAM83H-AS1和miR-383-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，F(xiàn)AM83H-AS1上游引物序列：5'-TAGGAAACGAGCGAGCCC-3'，下 游 引 物 序 列：5'-GCTTTGGGTCTCCCCTTCTT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物序列：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；miR-383-3p上 游引物序列：5'-TGCGGTCCAGCATCAGTGAT-3'，下游引物序列：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6上游引物序列：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。細胞增殖活性（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行蛋白定量。取50 μl蛋白樣品于10%SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，蛋白表達水平為目的條帶和GAPDH條帶的比值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞侵襲實 驗：Transwell小 室 上 室 加 入100 μl稀 釋 好 的Matrigel膠，添加后十字搖勻，在37℃培養(yǎng)箱放置40 min使之凝固。在Transwell小室上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl含血清培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光學(xué)顯微鏡（×200）下隨機選擇5個視野，拍照記錄并進行細胞計數(shù)。實驗重復(fù)3次。細胞遷移實驗：除不用Matrigel膠包被Transwell小室的上室，其余與細胞侵襲實驗操作相同。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測FAM83H-AS1對miR-383-3p的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-383-3p結(jié)合位點的FAM83H-AS1野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FAM83H-AS1和MUT-FAM83H-AS1，將WT-FAM83H-AS1和MUT-FAM83H-AS1分 別 與miR-NC和miR-383-3p共轉(zhuǎn)染至細胞EC9706中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達 與癌旁組織相比，食管癌組織中FAM83H-AS1表達水平顯著升高，miR-383-3p表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expression of lncRNA FAM83H-AS1 and miR-383-3p in esophageal cancer tissues（±s，n=9）

表1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expression of lncRNA FAM83H-AS1 and miR-383-3p in esophageal cancer tissues（±s，n=9）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Esophageal cancer tissues t P FAM83H-AS1 1.00±0.06 2.95±0.281）40.287 0.000 miR-383-3p 1.02±0.07 0.61±0.061）26.309 0.000

2.2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響 與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組食管癌EC9706細胞中FAM83H-AS1表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，CyclinD1表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Inhibitory effect of lncRNA FAM83H-AS1 on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 cells（±s，n=9）

表2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Inhibitory effect of lncRNA FAM83H-AS1 on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83H-AS1 t P FAM83H-AS1 1.01±0.07 0.49±0.051）18.135 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.42±0.04 0.36±0.031）3.600 0.002 48 h 0.73±0.07 0.47±0.041）9.675 0.000 72 h 1.13±0.09 0.61±0.061）14.422 0.000 CyclinD1 protein 0.57±0.05 0.22±0.021）19.498 0.000 p21 protein 0.28±0.03 0.68±0.061）17.889 0.000

圖1 增殖相關(guān)蛋白的表達Fig.1 Expression of proliferation-related proteins

2.3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組食管癌EC9706細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of lncRNA FAM83H-AS1 expression on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of lncRNA FAM83H-AS1 expression on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83HAS1 t P Migration cell number 105.36±10.22 51.36±5.111）14.178 0.000 Invasive cell number 91.36±9.14 42.65±4.381）14.418 0.000 MMP-2 protein 0.74±0.07 0.30±0.031）17.330 0.000 MMP-9 protein 0.64±0.06 0.24±0.031）17.889 0.000

圖2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響Fig.2 Effect of inhibiting expression of lncRNA FAM83HAS1 on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

2.4 lncRNA FAM83H-AS1靶向調(diào)控miR-383-3p的表達LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測顯示FAM83HAS1與miR-383-3p存在結(jié)合位點（圖3）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-383-3p組中轉(zhuǎn)染野生型表達載體WT-FAM83H-AS1的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染突變型表達載體MUT-FAM83H-AS1的細胞熒光素酶活性無顯著差異（表4）。與pcDNA組相比，pcDNA-FAM83HAS1組miR-383-3p表達水平顯著降低（P＜0.05），與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組miR-383-3p表達水平顯著升高（P＜0.05），見表5。

表5 lncRNA FAM83H-AS1調(diào)控miR-383-3p的表達（±s，n=9）Tab.5 lncRNA FAM83H-AS1 regulates miR-383-3p expression（±s，n=9）

表5 lncRNA FAM83H-AS1調(diào)控miR-383-3p的表達（±s，n=9）Tab.5 lncRNA FAM83H-AS1 regulates miR-383-3p expression（±s，n=9）

Groups pcDNA pcDNA-FAM83H-AS1 si-NC si-FAM83H-AS1 F P miR-383-3p 1.00±0.08 0.61±0.061）0.99±0.07 2.74±0.262）397.222 0.000

圖3 FAM83H-AS1的序列中含有與miR-383-3p互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of FAM83H-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-383-3p

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiments（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiments（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-383-3p t P WT-FAM83H-AS1 1.04±0.07 0.55±0.051）17.088 0.000 MUT-FAM83H-AS1 1.02±0.06 1.01±0.09 0.277 0.785

2.5 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-383-3p組食管癌EC9706細胞中miR-383-3p表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-383-3p overexpression on proliferation，migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

表6 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-383-3p overexpression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表6 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-383-3p overexpression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-383-3p t P miR-383-3p 1.01±0.07 3.05±0.291）20.514 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.41±0.04 0.39±0.03 1.200 0.248 48 h 0.76±0.07 0.53±0.051）8.021 0.000 72 h 1.18±0.11 0.69±0.061）11.732 0.000 Migration cell number 102.36±10.33 62.58±6.331）9.850 0.000 Invasive cell number 94.87±9.49 53.66±5.371）11.338 0.000 CyclinD1 protein 0.59±0.05 0.29±0.031）15.435 0.000 p21 protein 0.27±0.03 0.63±0.061）16.100 0.000 MMP-2 protein 0.75±0.07 0.34±0.031）16.151 0.000 MMP-9 protein 0.66±0.06 0.31±0.031）15.652 0.000

2.6 干擾miR-383-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用 與si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC組相比，si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p組食管癌EC9706細胞中miR-383-3p表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低（P＜0.05），見表7、圖5。

表7 干擾miR-383-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-383-3p expression reversed effect of inhibiting lncRNA FAM83H-AS1 expression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表7 干擾miR-383-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-383-3p expression reversed effect of inhibiting lncRNA FAM83H-AS1 expression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83H-AS1 si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p F P miR-383-3p 1.02±0.08 2.96±0.291）2.93±0.28 1.51±0.152）128.082 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.43±0.04 0.35±0.041）0.34±0.03 0.41±0.042）11.158 0.000 48 h 0.75±0.07 0.49±0.041）0.46±0.04 0.64±0.062）56.308 0.000 72 h 1.16±0.11 0.63±0.061）0.59±0.05 0.93±0.082）105.598 0.000 Migration cell number 106.33±9.87 54.22±5.411）52.69±5.22 89.65±8.222）115.050 0.000 Invasive cell number 96.33±9.57 45.21±4.511）43.69±4.33 88.24±8.742）134.573 0.000 CyclinD1 protein 0.58±0.05 0.23±0.021）0.21±0.02 0.49±0.042）253.408 0.000 p21 protein 0.29±0.03 0.67±0.061）0.69±0.06 0.38±0.032）164.367 0.000 MMP-2 protein 0.76±0.07 0.31±0.031）0.29±0.03 0.65±0.062）198.379 0.000 MMP-9 protein 0.63±0.06 0.26±0.031）0.24±0.03 0.52±0.052）169.937 0.000

圖5 干擾miR-383-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA FAM83HAS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用Fig.5 Interfering with expression of miR-383-3p reversed effect of inhibiting expression of lncRNA FAM83HAS1 on proliferation，migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

3 討論

我國食管癌的發(fā)病率及病死率較高，研究食管癌的發(fā)病機制，尋找新的靶向治療是目前的研究熱點［8］。lncRNA是生物體內(nèi)重要的調(diào)控分子，其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。研究報道FAM83H-AS1在膀胱癌組織和膀胱癌細胞系中高表達，其高表達與晚期臨床階段以及肌瘤浸潤的存在有關(guān)，是膀胱癌患者總體生存的獨立不良預(yù)后因素；沉默F(xiàn)AM83H-AS1可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)G0/G1期細胞周期停滯［10］。FAM83HAS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞系中上調(diào)表達，高水平的FAM83H-AS1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良有關(guān)；沉默F(xiàn)AM83H-AS1可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖［11］。下調(diào)FAM83H-AS1通過抑制Notch信號通路從而抑制結(jié)直腸癌細胞增殖［12］。以上研究結(jié)果表明FAM83H-AS1參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且發(fā)揮促癌作用。本實驗結(jié)果顯示，食管癌組織中FAM83H-AS1表達水平升高，抑制FAM83H-AS1表達，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高。說明抑制FAM83H-AS1表達可抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明miRNA不僅參與調(diào)節(jié)機體的各項基礎(chǔ)生命活動，還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療，miRNA為腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床診斷及治療帶來了新的啟示［13］。研究發(fā)現(xiàn)miR-383-3p通過抑制炎癥小體信號通路的激活來預(yù)防高半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠冠狀動脈內(nèi)皮細胞凋亡和炎癥損傷［14］。miR-338-3p在甲狀腺癌組織和細胞系中下調(diào)表達，且與甲狀腺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；miR-338-3p過表達在體外抑制了甲狀腺癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并抑制了腫瘤發(fā)生［15］。敲低HOXC13-AS通過 調(diào) 節(jié)miR-383-3p/HMGA2軸 抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲［16］。本實驗結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-383-3p低表達；過表達miR-383-3p，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高。說明過表達miR-383-3p可抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。且本實驗還發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1靶向調(diào)控miR-383-3p，干擾miR-383-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示，lncRNA FAM83H-AS1可能通過調(diào)控miR-383-3p表達影響食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，抑制lncRNA FAM83H-AS1表達可能通過上調(diào)miR-383-3p表達抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。