NLRP3炎癥小體在甲型流感病毒肺炎小鼠肺組織的表達(dá)水平及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)①

石云鋒 師小函 梁晶晶 陳健寧 江振友 吳本權(quán)（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510630）

甲型流感病毒（甲流病毒）引起流行性感冒為主的呼吸系統(tǒng)急性感染性疾病，但病毒性肺炎在甲型流感大流行時(shí)發(fā)病率明顯增高，并且在病程1周時(shí)易進(jìn)展為重癥病毒性肺炎或繼發(fā)細(xì)菌性肺炎，病死率高［1-2］。甲流病毒感染激活肺泡巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中的NOD樣受體蛋白3（NOD like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，后者引起IL-1β、IL-18的釋放并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是機(jī)體抗甲流病毒感染的主要機(jī)制［3］。在甲流病毒肺炎早期，NLRP3炎癥小體的激活及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有助于病毒的清除［4］。但在甲流病毒肺炎病程1周時(shí)，即進(jìn)展至重癥肺炎的高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期，NLRP3炎癥小體具體活性如何，國內(nèi)外未見深入研究。本研究以甲流病毒鼠肺適應(yīng)株H1N1/FM1滴鼻感染C57BL/6小鼠建立肺炎模型，探索NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達(dá)水平以及相應(yīng)的炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒及動(dòng)物 甲流病毒H1N1/FM1株為鼠肺適應(yīng)株，前期研究證實(shí)其引起小鼠病毒性肺炎的致病力［5］。C57BL/6小鼠15只，雄性，鼠齡30～35 d，購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程遵循《赫爾辛基宣言》相關(guān)原則及動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 主要試劑MLV第一鏈合成試劑盒、SYBR?select master mix購于美國Life Technologies公司；RT qPCR引物由美國Life Technologies公司設(shè)計(jì)并合成；NLRP3單克隆兔抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；caspase-1單克隆兔抗體購于美國Novus Biologicals公司；GAPDH兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、全蛋白提取試劑盒及BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購于廣州杰特偉科技有限公司；ELISA試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 甲流病毒H1N1復(fù)蘇、毒力測定 復(fù)蘇液氮罐中凍存的甲流病毒H1N1/FM1株，于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次擴(kuò)增后，以雞紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)測定擴(kuò)增的病毒效價(jià)。用無血清DMEM培養(yǎng)液對H1N1/FM1病毒株行連續(xù)2倍遞次稀釋至1∶1 280。確定病毒效價(jià)為1∶640及半數(shù)致死量（LD50）為2-2.83/50 μl。

1.2.2 甲流病毒H1N1滴鼻建立小鼠肺炎模型及分組 小鼠飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成空白對照組、24 h組和1周組，每組5只。腹腔注射10%水合氯醛80 μl麻醉小鼠后，空白對照組每只小鼠以50 μl PBS液滴鼻，24 h組及1周組每只小鼠以50 μl LD50濃度的甲流病毒H1N1滴鼻建立甲流病毒肺炎模型。24 h組感染24 h，1周組感染168 h（1周）。觀察并記錄小鼠的生存狀況、一般情況、體重等。體重變化率（%）=（實(shí)驗(yàn)點(diǎn)體重-初始體重）/初始體重×100%。

1.2.3 標(biāo)本取材 在各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，眼眶取血后頸椎脫臼法處死小鼠。分離血清，用于IL-1β濃度ELISA檢測。摘取小鼠肺臟，左肺上葉和下葉分別留作提取蛋白和RNA，右肺留作病理切片和HE染色。

1.2.4 RT-qPCR檢測肺組織NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平 將各組小鼠肺組織稱重后研磨制成懸液。用Trizol法提取組織總RNA，檢測RNA的濃度。應(yīng)用ABI7500系統(tǒng)行PCR檢測。反應(yīng)條件為：50℃2 min、95℃2 min預(yù)變性，95℃15 s變性，60℃1 min退火，95℃15 s、60℃1 min、95℃30 s、60℃15 s延伸，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。記錄目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)引物見表1。

表1 NLRP3、caspase-1和IL-1β的引物序列Tab.1 Primer sequences of NLRP3，caspase-1 and IL-1β

1.2.5 Western blot檢測肺組織NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)水平 裂解小鼠肺組織后，提取總蛋白。按凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書，測定蛋白濃度。按Western blot步驟，轉(zhuǎn)膜，封閉，給予相應(yīng)的一抗、二抗孵育，在Chemi Scope化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用Image J軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值，計(jì)算各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.6 ELISA檢測血清IL-1β的濃度 根據(jù)ELISA檢測試劑盒的操作流程，設(shè)復(fù)孔數(shù)為3，取測量數(shù)據(jù)的平均值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組小鼠血清IL-1β的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較選用單因素方差分析，兩組間比較滿足方差齊性的選擇LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較方差不齊的選擇Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存狀況及一般情況 各組小鼠均全部存活。空白對照組小鼠進(jìn)食、活動(dòng)如常，24 h后及1周后平均體重分別增加3.98%和10.54%。24 h組及1周組小鼠均出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、毛色無光澤、攝食量下降、活動(dòng)減少等情況。24 h組平均體重減輕6.78%，1周組在24 h后及1周后平均體重分別減輕4.31%與19.28%。

2.2 小鼠肺組織病理及肺炎模型的建立 空白對照組小鼠肺組織病理切片示正常肺組織，支氣管壁完整，肺泡內(nèi)及組織間隙無明顯腫脹，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。24 h組小鼠肺組織見局灶性支氣管炎和彌散性間質(zhì)肺炎，見較多的炎癥細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。1周組小鼠肺組織病理可見炎癥反應(yīng)較24 h組加重，炎癥細(xì)胞浸潤及充血更加明顯，并可見局灶性實(shí)變（圖1）。

圖1 甲流病毒H1N1感染致小鼠肺炎組織病理改變Fig.1 Pathology of pneumonia caused by IAV H1N1 infection in mice

2.3 小鼠肺組織NLRP3、caspase-1的mRNA及蛋白相對表達(dá)量RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3的mRNA表達(dá)明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=221.051，P＜0.05，圖2）。caspase-1的mRNA表達(dá)水平也升高，1周組比空白對照組、24 h組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=116.656，P＜0.01，圖2）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3的蛋白表達(dá)水平明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 194.353，P＜0.01，圖3），此變化趨勢與mRNA表達(dá)水平的結(jié)果相一致。caspase-1的蛋白表達(dá)水平明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=173.997，P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot檢測甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3與caspase-1的蛋白相對表達(dá)量Fig.3 Protein levels of NLRP3 and caspase-1 in IAV pneumonia in mice measured by Western blot

2.4 小鼠肺組織IL-1β的mRNA相對表達(dá)量及血清IL-1β濃度RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)甲流病毒肺炎小鼠肺組織IL-1β的mRNA表達(dá)升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=439.687，P＜0.01，圖4A）。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)甲流病毒肺炎小鼠血清IL-1β濃 度 升 高，24 h組（189.486±2.268）、1周 組（219.010±2.577）均 較 空 白 對 照 組（152.190±6.908）升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=169.575，P＜0.01，圖4B）。

圖4 甲流病毒肺炎小鼠肺組織IL-1β的mRNA相對表達(dá)量和血清IL-1β濃度Fig.4 Relative mRNA expression level and serum concentrations of IL-1β in IAV pneumonia in mice

3 討論

甲流病毒感染呼吸系統(tǒng)引起流行性感冒、支氣管炎、肺炎等疾病。甲流病毒通過感染并破壞呼吸道上皮細(xì)胞，直接引起肺損害。此外，甲流病毒的RNA、M2蛋白等結(jié)構(gòu)成分激活肺泡巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)間接加劇肺損傷［1］。甲流病毒感染的預(yù)后取決于病毒負(fù)荷量、炎癥反應(yīng)強(qiáng)度以及有無繼發(fā)感染［6］。流行性感冒有自限性的特點(diǎn)，感染1周時(shí)間是炎癥反應(yīng)的高峰期，固有免疫及體液免疫相繼激活后病毒清除及病情緩解［7］。但甲流病毒肺炎在感染1周時(shí)易進(jìn)展為重癥病毒性肺炎，或者繼發(fā)細(xì)菌性肺炎，該病理狀況是甲流病毒感染者臨床死亡的主要原因［8］。

肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量占肺泡灌洗液中細(xì)胞成分的80%，是介導(dǎo)甲流病毒感染引起炎癥反應(yīng)最重要的效應(yīng)細(xì)胞［9］。而肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的NOD樣受體（NOD like receptor，NLRs）及其活性形式炎癥小體，是其抗甲流病毒免疫的主要機(jī)制［3，10］。

NLRP3炎癥小體是抗甲流病毒免疫炎癥小體的主要成員，其結(jié)構(gòu)成分包括NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）與半胱天冬酶1（caspase-1），以NLRP3為核心結(jié)構(gòu)。NLRP3炎癥小體抗甲流病毒免疫過程包含兩條信號通路。信號通路1為Toll樣受體17（TLR17）識別甲流病毒RNA及M2蛋白，通過NFκB途徑，誘導(dǎo)NLRP3、caspase-1以及IL-1β基因的表達(dá)，生成NLRP3、caspase-1以及pro-IL-1β。信號通路2為NLRP3炎癥小體三聚體形成，自剪切無活性的caspase-1為活化的cleaved-caspase-1，cleavedcaspase-1剪切pro-IL-1β為活性的IL-1β并分泌出細(xì)胞外［4］。IL-1β作為炎癥反應(yīng)上游的細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)并清除病原體［11-12］。

對NLRP3炎癥小體初期的研究認(rèn)為，NLRP3炎癥小體在抗甲流病毒免疫中被激活并引起炎癥反應(yīng)，對機(jī)體起保護(hù)作用［13-14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比，24 h組NLRP3、caspase-1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，IL-1β的mRNA表達(dá)及血清濃度也升高，表現(xiàn)出NLRP3炎癥小體信號通路1以及信號通路2均活化。24 h組小鼠肺組織病理示輕度炎癥反應(yīng)。該部分研究結(jié)果驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎的早期即被激活并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而適度的炎癥反應(yīng)有助于病毒的清除，該結(jié)論與主流的研究相一致。

但近年越來越多研究認(rèn)為，在甲流病毒感染1周后，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對機(jī)體是有害的［15-16］。JIA等［17］發(fā)現(xiàn)，在甲流病毒肺炎后期加用奧司他韋聯(lián)合西羅莫司，有助于減輕肺損害，而該效應(yīng)是由奧司他韋與西羅莫司抑制了NLRP3炎癥小體的活性介導(dǎo)的。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為，抑制NLRP3炎癥小體信號通路從而減輕劇烈的炎癥反應(yīng)是甲流病毒肺炎治療的新方向［18-19］。ZHANG等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在甲流病毒肺炎的病程中，存在兩波炎癥細(xì)胞因子的高峰，第二波炎癥細(xì)胞因子的高峰在病程7 d左右，但該研究未進(jìn)一步研究其機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，在甲流病毒肺炎的1周時(shí)間，NLRP3及caspase-1的表達(dá)比早期進(jìn)一步升高，IL-1β的轉(zhuǎn)錄及分泌也進(jìn)一步增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)小鼠的健康狀況及肺炎病理亦證實(shí)炎癥反應(yīng)在1周時(shí)明顯加重。血清IL-1β濃度體現(xiàn)的是全身性的炎癥反應(yīng)水平，該結(jié)果支持了ZHANG等的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在感染1周時(shí)的進(jìn)一步激活可能參與了第二波炎癥細(xì)胞因子高峰的機(jī)制。本研究結(jié)果也與臨床工作觀察到的甲流病毒肺炎病例在感染1周后進(jìn)展為重癥病毒性肺炎或繼發(fā)細(xì)菌性肺炎的現(xiàn)象相一致。NLRP3炎癥小體在感染1周時(shí)的進(jìn)一步激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是甲流病毒肺炎進(jìn)展為重癥病毒性肺炎的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎小鼠肺組織的表達(dá)水平及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，感染1周后NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平及小鼠肺組織炎癥反應(yīng)比肺炎早期明顯增強(qiáng)，推斷該效應(yīng)可能是甲流病毒肺炎進(jìn)展為重癥病毒性肺炎的機(jī)制之一。同時(shí)，NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎的具體作用以及與其他的信號通路的關(guān)系，都有待更深入的研究，這是本實(shí)驗(yàn)的局限與展望。