使用一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管進(jìn)行無創(chuàng)小鼠氣管插管的方法建立

趙聰慧王 妍周 禹袁曉紅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院病理科,北京 100050;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院,太原 030001;3.山西醫(yī)科大學(xué)肝病與器官移植研究所,太原 030001;4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,北京 100050)

肺疾病為常見的呼吸系統(tǒng)疾病,極大損害了人類健康,對(duì)社會(huì)造成勞動(dòng)力和醫(yī)療資源損失。通過構(gòu)建動(dòng)物肺部疾病模型,可以直觀研究疾病發(fā)病機(jī)制,動(dòng)態(tài)演變以及評(píng)估藥物治療效果。由于小鼠肺部疾病模型造模指向性強(qiáng),需要直接將造模藥物均勻輸送到肺組織中。因此包括哮喘模型[1],肺纖維化模型[2],急性肺組織損傷模型[3],病毒感染模型[4]等肺部疾病模型均使用氣管插管法造模。小鼠體型較小,呼吸道狹窄,不易發(fā)現(xiàn)氣管入口。霧化吸入是常用的方法之一,操作簡(jiǎn)便,可批量處理。但是,此方法存在藥品消耗大,每只動(dòng)物吸入劑量不可控等缺點(diǎn)。滴鼻法操作簡(jiǎn)便,但是藥物部分進(jìn)入食道,造成不同動(dòng)物之間實(shí)際給藥劑量差異。并且,研究表明經(jīng)口鼻吸入法造模效果不及氣管插管法[5]。目前為止,多種小鼠氣管插管技術(shù)已被報(bào)道,可以歸類為“有創(chuàng)法”、“無創(chuàng)直接法”和“無創(chuàng)輔助法”,這些方法各有優(yōu)勢(shì),但仍存在不足。有創(chuàng)小鼠氣管插管技術(shù)雖然經(jīng)過優(yōu)化將動(dòng)物損傷降到最低,但是仍不利于小鼠長期生存和多次給藥[6-8];無創(chuàng)輔助法通過使用輔助工具,例如使用光源[9-12]或者光源和纖維引導(dǎo)絲組合[13],從而直接可視化小鼠氣管入口并將插管引入氣管。但是,由于小鼠氣管狹窄,入口仍然不便直接觀察,且對(duì)于實(shí)驗(yàn)器材獲取和實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)技術(shù)要求較高;無創(chuàng)直接法也稱為“盲插法”,此方法不使用任何輔助,直接經(jīng)小鼠口腔插入氣管,操作最為簡(jiǎn)便,但手法難以掌握,并且成功插入與否難以把控。

綜合目前已經(jīng)報(bào)道的小鼠氣管插管技術(shù),同時(shí)參考大鼠氣管插管技術(shù),結(jié)合實(shí)際在構(gòu)建小鼠肺部疾病模型經(jīng)驗(yàn),我們建立了一套操作簡(jiǎn)單,成本低廉,重復(fù)性好,對(duì)操作要求較低的小鼠氣管插管方法。并總結(jié)出本方法訓(xùn)練方法。本方法立足于無創(chuàng)“盲插”法,組裝包括一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管,1 mL注射器,10μL移液器槍頭在內(nèi)的常見實(shí)驗(yàn)耗材作為氣管插管工具,并總結(jié)出插入氣管的判斷依據(jù)。使用本方法給藥,過程舒緩程度可控,一名操作人員即可快速完成實(shí)驗(yàn)。本方法將有助于小鼠肺部疾病模型的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠,雌性,20只,6周齡,體重18~22 g。購于北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2019-0023],于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物房中飼養(yǎng)[SYXK(京)2019-0023],光照黑暗交替照明(12 h/12 h),自由飲水,進(jìn)食,溫度22℃左右,相對(duì)濕度50%左右。本實(shí)驗(yàn)已通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)(00005199),實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R原則并對(duì)動(dòng)物給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

1%戊巴比妥鈉;臺(tái)盼藍(lán)染液;1 mL注射器(BD);胰島素注射針(BD);一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管;10μL移液器槍頭;縫合線;移液器架;眼科剪;眼科鑷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠氣管插管簡(jiǎn)易裝置制作

小鼠氣管插管簡(jiǎn)易裝置組成如圖1A所示,一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管1支,10μL移液器槍頭若干,1 mL注射器一支,胰島素注射針1支。首先將硬膜外麻醉導(dǎo)管軟管對(duì)折,從中間剪開,插管時(shí)使用其中一半即可,將其中一端側(cè)面開口剪去(硬膜外麻醉導(dǎo)管的一端為側(cè)面開口),改為頂端開口。將處理好的軟管與進(jìn)藥裝置組合,并旋緊螺絲扣。使用胰島素注射針吸取給定劑量藥物(此處為臺(tái)盼藍(lán)染液或PBS),將其通過進(jìn)藥裝置注入軟管內(nèi)。需要說明的是,使用的胰島素注射針與硬膜外麻醉導(dǎo)管的進(jìn)藥口必須緊密對(duì)接,并且該注射器沒有死腔,有利于精確控制給藥劑量。建議每次只吸取1只小鼠的劑量。將藥物注入導(dǎo)管完畢后,使用1 mL注射器將針頭棄去不用,將注射器調(diào)整至最大量程處,與進(jìn)藥口緊密對(duì)接,此處注射器當(dāng)作“氣筒”使用。小心調(diào)節(jié)注射器,觀察軟管中液平面,將其控制在距離軟管出口處3~5 cm左右位置,以便于觀察。將軟管出口處套入10μL移液器槍頭內(nèi),以液體不外露為準(zhǔn),如圖1B所示。氣管插管裝置和藥物準(zhǔn)備完成。

圖1 小鼠氣管插管簡(jiǎn)易裝置Note.A,Tools for tracheal intubation.B,Assembled tracheal intubation tools for mice.Figure 1 Simple tracheal intubation tools for mice

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

1%戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠,麻醉過淺在插管時(shí)會(huì)產(chǎn)生嘔吐反射,不利于找到氣管位置。小鼠以使用鑷子夾住四肢無反應(yīng),雙眼濕潤,呼吸規(guī)律且較為深長為佳。使用縫合線,將小鼠懸掛于移液器架上。

1.3.3 小鼠氣管插管過程

使用縫合線將小鼠懸空掛于移液器架上,高度以操作人員舒適為準(zhǔn)。使用眼科鑷小心將小鼠舌頭拔出。如圖2所示,左手大拇指放在小鼠頸前部,指肚緊貼小鼠頸部(重要),其余手指置于小鼠后頸部固定小鼠,以免搖晃。右手手持套入軟管的移液器槍頭,沿小鼠下顎,抵住小鼠舌頭緩緩插入小鼠口中,在抵達(dá)小鼠會(huì)厭部時(shí),會(huì)感受到阻力,這是小鼠會(huì)厭軟骨所造成,此時(shí)不可用蠻力向下,以免傷及小鼠。將槍頭稍稍回撤,而后將槍頭下端向小鼠頸部腹側(cè)反方向向下一小段距離(此時(shí)操作員面對(duì)小鼠,小鼠頸部腹側(cè)正對(duì)操作員臉部),而后轉(zhuǎn)向頸部腹側(cè)表皮方向輕輕挑一下,同時(shí)將槍頭向下,目的為挑過會(huì)厭軟骨將槍頭送入小鼠氣管。當(dāng)感覺槍頭越過阻礙后,將槍頭抵住左手拇指肚,輕柔地上下摩擦,注意動(dòng)作輕柔。此時(shí)如果插入氣管,應(yīng)感覺到移液器槍頭與氣管軟骨摩擦“一楞一楞”的感覺,這個(gè)感覺就是成功插入小鼠氣道的判斷依據(jù),同時(shí)也是本技術(shù)的重點(diǎn),如果插入食道則左手拇指肚感受到平滑感。此時(shí)觀察軟管中的液面,如果插入氣管中,液面應(yīng)該波動(dòng)并向小鼠方向移動(dòng)。當(dāng)成功插入氣管后,左手把住槍頭,右手持注射器,緩慢推進(jìn),直至軟管內(nèi)液體全部進(jìn)入后繼續(xù)打入0.5 mL刻度的氣體,迅速拔掉槍頭。

圖2 小鼠氣管插管手法Figure 2 Schematic diagrams of tracheal intubation by epidural anesthesia catheter

小鼠懸掛30 s后即可取下。若插管成功,小鼠呼吸應(yīng)該從麻醉的深長呼吸狀態(tài)變?yōu)槎檀俸粑鼱顟B(tài),此狀態(tài)會(huì)維持?jǐn)?shù)分鐘,直至漸漸變?yōu)橐?guī)律的深長呼吸,此時(shí)呼吸聲音明顯增加。

1.3.4 注意事項(xiàng)

(1)小鼠麻醉程度要控制得當(dāng),麻醉淺小鼠會(huì)出現(xiàn)掙扎情況,麻醉過深則容易窒息死亡;(2)給藥體積控制在每只小鼠30~50μL,少于30μL不利于藥物均勻分布,多于50μL則容易造成小鼠窒息死亡;(3)插管的深度不宜過深,應(yīng)控制在氣管中上部分,不宜過度接近氣管分支部分,以免造成藥物偏向一側(cè)肺組織;(4)氣管插管過程中,由于小鼠個(gè)體差異和狀態(tài)不同,不同小鼠插管的難易程度略有不同,建議連續(xù)2~3次插管不成功(遇到阻力,回撤再向下為一次)將小鼠取下休息一段時(shí)間,并且過程一定要輕柔,以免損傷小鼠或者造成窒息;(5)插管成功的依據(jù)是左手拇指有“一楞一楞”的感覺,因此應(yīng)保持左手拇指的位置正確和敏感性,少部分情況即使成功插入氣管,軟管中液面的波動(dòng)亦不明顯;(6)此方法雖然簡(jiǎn)單,但是需要操作人員有一定的練習(xí),可采用先將小鼠解剖,完全暴露小鼠頸部組織結(jié)構(gòu),體會(huì)槍頭插入的位置和程度;(7)我們使用的是10μL移液器槍頭,這個(gè)部分可以換做任何可以與導(dǎo)管頭接合的器具,以使用順手為目的,原則是足夠細(xì),并且不會(huì)傷及小鼠;(8)推入液體時(shí)速度應(yīng)保持中速和穩(wěn)定,確定將液體全部推入后,應(yīng)繼續(xù)進(jìn)氣0.5 mL左右,以保證液體進(jìn)入肺組織深部。有文章提出,補(bǔ)氣有助于滴注物擴(kuò)散,防止動(dòng)物窒息,但由于小鼠肺總?cè)萘啃?補(bǔ)氣量為0.6~0.8 mL[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用Two-way ANOVA檢驗(yàn),P＜0.05、P＜0.01以及P＜0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

如圖3所示,通過氣管插管給予小鼠臺(tái)盼藍(lán)染液,可見小鼠肺組織均勻藍(lán)染,同時(shí)胃中沒有藍(lán)色,證明染液均勻分布于肺組織中。通過氣管插管給予PBS組小鼠,在麻醉劑作用失效后,存活情況良好,無小鼠死亡。證明上述操作安全可靠。使用上文所述小鼠氣管插管方法,我們已經(jīng)完成多種、多次小鼠肺部疾病模型造模,包括IL-33誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型,博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型,以及LPS引發(fā)的急性肺損傷模型。對(duì)于氣管插管造模的成功率,我們以博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化為例,如圖4所示。相比于對(duì)照組,模型組小鼠體重有顯著下降,并且數(shù)據(jù)變異度小,證明模型發(fā)病率高,造模方法穩(wěn)定。如圖5A所示,使用此方法構(gòu)建博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型28 d后,安樂死小鼠取肺組織,進(jìn)行病理學(xué)分析,HE染色顯示對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡間無雜質(zhì),無炎性細(xì)胞浸潤,模型組小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)消失,原本肺泡組織被大量細(xì)胞外基質(zhì)填充,可見炎性細(xì)胞浸潤。Masson染色顯示相比對(duì)照組,模型組小鼠肺組織著色顯著。同時(shí)如圖5B所示,免疫組化染色表明,肺纖維化標(biāo)志αSMA、Collagen I和Vimentin在模型組顯著表達(dá)增高。綜上,病理分析表明小鼠肺纖維化模型成功。

圖3 氣管插管給予小鼠臺(tái)盼藍(lán)染液后,肺組織和胃染色情況Figure 3 Trypan blue staining of mouse lung and stomach after intratracheal intubation

圖4 經(jīng)氣管插管使用博來霉素小鼠肺纖維化造模后小鼠體重變化統(tǒng)計(jì)(n=7)Note.Compared with the control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 4 Body weights(%)of animals after bleomycin intratracheal intubating

小鼠氣管插管過程中,由于個(gè)別小鼠較為敏感或者手法問題,會(huì)出現(xiàn)小鼠因窒息死亡現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為,小鼠眼球突出眼眶,出現(xiàn)身體蜷曲張口深大呼吸等呼吸困難表征,此為小鼠窒息前兆,如無此現(xiàn)象小鼠不會(huì)窒息死亡。通過手法逐漸熟練和給與的液體量減少,小鼠死亡現(xiàn)象顯著下降。

3 討論

小鼠肺部疾病模型需要將造模藥物直接并且均勻輸送到肺組織中,口服,靜脈/腹腔/皮下注射等造模方式不能完全滿足需求。張曉曄等[15]比較經(jīng)尾靜脈和經(jīng)氣管進(jìn)行小鼠肺纖維化造模,結(jié)果表明動(dòng)物肺纖維化程度尾靜脈造模組低于氣管造模組(但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異),且小鼠肺組織病變部位二者存在顯著差異。由于小鼠體積較小,口腔空間狹窄,導(dǎo)致難以準(zhǔn)確找到氣管開口位置。因此掌握成熟、穩(wěn)定的氣管插管技術(shù)就顯得尤為重要。

由于大鼠也常被用于構(gòu)建肺部疾病模型,因此大鼠的氣管插管方法也可參考[16-17]。已報(bào)道的各類方法可分為“有創(chuàng)性插管”,“使用輔助工具無創(chuàng)性插管”和“無創(chuàng)性直接插管”(也被稱作“盲插”)。有創(chuàng)性插管采用暴露部分氣管,將藥物注射入動(dòng)物氣管內(nèi)。此方法經(jīng)過多次改良,力求盡可能減少對(duì)動(dòng)物損傷,但是依舊易導(dǎo)致動(dòng)物死亡,并且不利于多次干預(yù)。使用輔助工具無創(chuàng)性插管的改進(jìn)在于使用光源,或光源與體試鏡,導(dǎo)引絲結(jié)合,在無創(chuàng)條件下將氣管入口可視化,提高插管成功率。有報(bào)道分別使用小鼠和大鼠比較了經(jīng)口直視插管組和經(jīng)頸透照直視插管的優(yōu)劣,認(rèn)為經(jīng)頸透照直視插管可靠性更佳[18-19]。使用輔助工具無創(chuàng)性插管準(zhǔn)確性高,對(duì)動(dòng)物傷害小,但是仍有不足。一方面對(duì)于操作人員技術(shù)要求較高或者需要兩人一起操作,另一方面需要購買或自制相關(guān)設(shè)備。相比之下“盲插”具有成本低廉,上手較快等優(yōu)點(diǎn)。但是,此方法具有無法準(zhǔn)確判定是否進(jìn)入氣管,插管手法難以掌握這兩大缺點(diǎn)。王凱等[20]在比較不同方法建立大鼠間質(zhì)性肺炎模型中摸索出一套切實(shí)可用的大鼠氣管“盲插”手法。但是提及的“輕微阻力”和“摩擦感”兩個(gè)插入氣管的特征,并不能準(zhǔn)確判定工具進(jìn)入氣管。而且小鼠相比于大鼠,由于體積更小,氣管更加狹窄,不利于插管。因此有必要改進(jìn)“盲插”法以更好的適應(yīng)小鼠實(shí)驗(yàn)。

本文立足于“盲插”法,使用硬膜外麻醉導(dǎo)管,移液器槍頭,注射器等常用實(shí)驗(yàn)耗材,并通過手指的感覺確定進(jìn)入氣管,給藥過程可控制速度,且藥物可均勻分布到肺組織中。器材選用方面,已報(bào)道的方法多使用滯留針,穿刺針和移液器槍頭等。相比于鐵質(zhì)針頭,移液器槍頭不易損傷組織。通過比較不同氣管插管方法造小鼠肺纖維化模型的情況,提出插管深度對(duì)藥物分散和造模效果直接相關(guān)[21]。10μL移液器槍頭可滿足進(jìn)入氣管一定深度。連接硬膜外麻醉導(dǎo)管后,可將推注使用的移液器放置于合適位置,有助于控制推注過程。本方法操作手法需要一定的練習(xí),可先在解剖條件下觀察插管時(shí)槍頭在小鼠咽喉部的位置,記住在何處有阻力,如何避開會(huì)厭軟骨隔擋。在熟練掌握手法后,每只小鼠插管給藥時(shí)間可控制在1~2 min內(nèi),并且在50μL以內(nèi)的給藥體積小鼠被直接嗆死的比例小于10%。使用本方法,我們已經(jīng)建立了IL-33誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型,LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型,博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型。模型成功率接近100%,并且出模率穩(wěn)定。通過更換所使用的工具,以相同的判定方式和手法,本方法也可適用于大鼠氣管插管給藥。

綜上,我們?cè)跓o創(chuàng)無可視輔助工具的條件下,經(jīng)過改良和創(chuàng)新,建立了一套成本低廉,原料易得,上手容易,并且高效,穩(wěn)定的小鼠氣管插管方法,此方法將有助于更多小鼠肺組織疾病模型研究。