miR-302c靶向CREB1基因通過P53信號通路影響肺癌的侵襲和遷移

張冉 石長林 茍小軍 何鴻晏

作者單位：四川省巴中市中心醫(yī)院胸心外科（四川省巴中市636000）

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1]。肺癌是由肺部上皮細胞的異常增殖導(dǎo)致，但其具體機制尚未闡明，盡管手術(shù)、放化療等治療手段有了較為明顯的突破，但晚期肺癌患者的5年生存率仍未明顯改善。有研究[2]顯示，導(dǎo)致肺癌患者治療失敗的主要原因是淋巴、胃等器官的惡性轉(zhuǎn)移。因此，深入揭示肺癌的發(fā)病、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找腫瘤轉(zhuǎn)移的分子靶點，有助于臨床上開展個體化的靶向治療，提高晚期肺癌患者的生存[3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是包含19～22個核苷酸的單鏈非編碼的生物小分子。有研究顯示，miRNA 在癌細胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮促癌或抑癌作用[4]。miR-302c 屬于miR-302 家族中的一員，在肝癌、膠質(zhì)瘤、胃癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。Ye 等[5]研究報道m(xù)iR-302c 在肺癌中表達異常，與患者的不良預(yù)后關(guān)系密切。但并未詳細探討miR-302c在肺癌中的作用機制。轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1（cAMP-responsive elementbinding protein-1，CREB-1）是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因[6]。Jiang 等[7]研究表明，作為機體內(nèi)重要的原癌基因，CREB-1 在白血病、腎癌、乳腺癌等腫瘤組織中的表達高于正常組織，且在腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)CREB-1 在肺癌中的報道較少。本研究通過對在線數(shù)據(jù)庫以及肺癌細胞株A549的研究，探討miR-302c 和CREB-1 在肺癌中的作用機制，以期為臨床上肺癌的個體化治療提供潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 永生化人肺支氣管上皮細胞BEAS-2B、人肺癌A549 細胞、人胚胎腎細胞293T 均購自美國ATCC，miR-302c-mimic 和miR-302c-mimic-NC 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.2 試劑與儀器 鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自美國Jackson 公司；CCK-8試劑盒、Western blot 試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell 小室購自美國Sigma-Aldrich 公司；蘇凈Airtech 超凈工作臺購自美國Thermo Fisher 公司；BD-56 集成式恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱購自德國BINDER 公司；IXplore Standard 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；Multiskan Sky 全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；Hitachi H-600 透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.1.3 在線生物數(shù)據(jù)庫信息 收集在線生物基因數(shù)據(jù)庫GEO 中GSE19945 和GSE136043 兩組肺癌數(shù)據(jù)集信息。GSE19945 為手術(shù)切除的肺癌組織樣本的miRNA 芯片數(shù)據(jù)，包括8 例正常肺組織、4 例肺腺癌、11例大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、35 例小細胞肺癌、5例鱗狀細胞癌。GSE136043 為15 例肺腺癌組織、25例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織以及5 例正常組織的miRNA 芯片數(shù)據(jù)。Kmplot 網(wǎng)站（https://kmplot.com/analysis/）用于評估數(shù)據(jù)庫中的肺癌樣本中的生存率，通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得差異表達的基因，獲取靶標信息[8]。

通過Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）分析CREB1 在正常人體不同組織中的分布情況，以及CREB1 在正常肺組織以及肺癌中的表達情況[9]。

1.2 方法

1.2.1 定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測BEAS-2B 細胞和A549 細胞中miR-302c 和CREB1的mRNA 的表達 使用Trizol 試劑盒分別提取細胞總RNA，根據(jù)Prime Scrip TM 試劑要求逆轉(zhuǎn)錄生成反義cDNA，以此為模板采用PCR 儀進行擴增[10]（95℃，5 s，單次循環(huán)后；95℃，5 s；60℃，60 s，采集熒光信號40 個循環(huán)）；各目的基因mRNA 的相對表達量采用2–△△CT表示。使用序列如下：

內(nèi)參U6 上游引物為 5’-GCCAAGGCTGTGGGC AAGGT-3’，下游引物為 5’-TCTCCAGGCGGCACG TCAGA-3’；miR-302c 上游引物為 5’-AGCCTTGCAG AAAAGAGAGC-3’，下游引物為5’-AGCTAGTTGTC ATCCTGCT-3’；CREB1 mRNA 上游引物為 5’-AGC TAGTTGTCATCCTGCT-3’，下游引物為5’-AGGAAG TCTTTCAGTGATGT-3’。

1.2.2 雙熒光素酶實驗 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRactDB（https://ccsm.uth.edu/miRactDB）判斷miR-302c 和CREB1 存在特異性結(jié)合位點。推測CREB1可能為miR-302c 的靶基因。293T 細胞常規(guī)培養(yǎng)，依次構(gòu)建突變型pGL3-CREB1-3-UTR-MUT 和野生型pGL3-CREB1-3-UTR-WT 質(zhì)粒，將100 ng 質(zhì)粒通過Lipofectamine2000分別共轉(zhuǎn)染至293T 細胞，按試劑盒要求培養(yǎng)細胞，48 h 后以PROMEGA 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶的活性比值[11]。

1.2.3 細胞培養(yǎng)以及分組處理[12]將人A5491 接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。將細胞分為正常組、對照組和實驗組，正常組不加任何藥物，常規(guī)培養(yǎng)；對照組將細胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L 的miR-302c-mimic-NC 后常規(guī)培養(yǎng)；實驗組將細胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L 的miR-302c-mimic 后常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變 調(diào)整細胞的濃度至1×106個/mL 接種于6 孔板上，分組處理同上，將細胞在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，固定，包埋，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色[13]，Hitachi H-600 透射電子顯微鏡下觀察各組細胞的超微結(jié)構(gòu)改變。

1.2.5 Transwell 實驗 在Transwell 小室平板平鋪一層Matrigel 基質(zhì)膠（約50 μL）并將以無血清培養(yǎng)基中的各組單細胞懸液加至上室（侵襲實驗中鋪Matrigel 膠，遷移實驗中不鋪膠），在小室下室平鋪含有滅活的10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，清洗后，甲醛固定；染色后，顯微鏡下觀察并對穿過膜的細胞進行計數(shù)[14]。

1.2.6 小管形成實驗 在96 孔培養(yǎng)板上平鋪一層新鮮Matrigel 溶膠，迅速轉(zhuǎn)移進無菌培養(yǎng)箱（37℃），待Matrigel 溶膠凝固后，將HUMCEs 細胞以1×104個/mL接種在96 孔板中，分組同上，分別加入含A549 細胞的培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察HUMCEs 的血管生成情況并拍照記錄[15]。

1.2.7 Western blot 檢測 胰酶消化細胞，離心稀釋成細胞懸液，分組處理同上，按1×105個/孔接種至6孔板中培養(yǎng)24 h，加入蛋白裂解液，常規(guī)提取總蛋白，測定濃度，置于沸水中變性，進行電泳分離，轉(zhuǎn)模，清洗后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗（1∶500），孵育過夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色[16]，以GAPDH 作為內(nèi)參，Image J 圖像分析軟件統(tǒng)計分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Graphpad5.01 繪制統(tǒng)計圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-302c 和CREB1 在肺癌組織中的表達

針對數(shù)據(jù)集GSE19945 中的標本進行分析，結(jié)果顯示miR-302c 在肺癌中的表達最低（圖1）；針對數(shù)據(jù)集GSE136043 的標本進行分析，結(jié)果顯示miR-302c在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的表達水平降低（圖2）。兩數(shù)據(jù)集經(jīng)Kmplot 分析顯示，miR-302c 高表達的肺癌患者的生存期為（77.52±8.45）個月，明顯高于miR-302c 低表達的肺癌患者（45.92±6.43）個月（圖3），提示miR-302c 在肺癌中的表達與患者的預(yù)后以及惡性轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

圖1 在GSE19945 樣本中表達差異明顯的miRNA 的熱圖

圖2 miR-302c 在GSE136043 樣本中表達差異明顯的miRNA 的熱圖

圖3 miR-302c 不同表達水平患者的生存期

Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫顯示，CREB1 在腦、鼻咽、胃、肝、腎、支氣管、肺等組織和器官中廣泛存在，數(shù)據(jù)內(nèi)的組織樣本經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測后，與正常組織相比，肺癌組織中CREB1 的表達明顯升高（圖4）。

圖4 CREB1 在人體中以及肺臟和肺癌組織中的表達

2.2 qRT-PCR 檢測BEAS-2B 細胞及A549 細胞中miR-302c 和CREB1 mRNA 的表達

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與正常BEAS-2B 細胞相比，A549 細胞中miR-302c 的表達明顯下降，CREB1 的mRNA 表達明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05，圖5）。

圖5 細胞系中miR-302c 和CREB1 的mRNA 表達

2.3 雙熒光素酶實驗

上述研究結(jié)果提示，在肺癌中miR-302c 和CREB1 基因的表達具有一定的相關(guān)性；在線生物信息數(shù)據(jù)庫miRactDB 顯示miR-302c 和CREB1 基因存在特異性結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-302c 后，野生型CREB1 的熒光素酶活性被抑制（P<0.05），突變型CREB1 熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），提示miR-302c 與CREB1 具有靶向調(diào)控關(guān)系（表1，圖6）。

圖6 雙熒光素酶實驗

表1 miR-302c 和CREB1 基因的結(jié)合位點

2.4 電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡觀察結(jié)果顯示，正常組細胞結(jié)構(gòu)完整，清晰可辨，細胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)容物數(shù)量豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體以及高爾基體等細胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨，核質(zhì)界限清晰；對照組細胞的細胞質(zhì)界限清晰，線粒體嵴結(jié)構(gòu)正常，核仁性狀穩(wěn)定；實驗組細胞的細胞質(zhì)界限不清，胞膜缺失嚴重，線粒體呈現(xiàn)空泡樣變性，嵴結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，染色質(zhì)固縮、聚集明顯，核膜凹陷缺失明顯，細胞超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重（圖7）。

圖7 各組細胞超微結(jié)構(gòu)的改變（×8 000）

2.5 Transwell 小室檢測細胞的侵襲與遷移能力

Transwell 小室結(jié)果顯示，與正常組相比，實驗組遷移和侵襲的細胞數(shù)量明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；正常組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖8，9）。

圖8 Transwell 小室遷移實驗

2.6 小管形成實驗檢測血管生成能力

小管形成實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，實驗組細胞小管生成的數(shù)量明顯下降（P<0.05）；正常組與對照組相比，差異無統(tǒng)計意義（P>0.05，圖10）。

圖10 小管形成實驗

2.7 Western blot 檢測細胞中CREB1、p-P53、p-P21的表達水平

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中研究發(fā)現(xiàn)，CREB1 和P53 存在調(diào)控位點（圖11），為進一步探索CREB1 基因的作用通路，采用Western blot 檢測各組細胞中P53、P21的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與正常組相比，實驗組細胞中CREB1 的表達明顯下降，p-P53、p-P21 的表達明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；正常組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖12）。

圖9 Transwell 小室侵襲實驗

圖11 CREB1 和P53 存在調(diào)控位點

圖12 各組細胞中CREB1、p-P53、p-P21 的表達

3 討論

作為一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，肺癌的發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤前列。目前，臨床上主要以放療、化療、手術(shù)以及免疫治療為主，但在提高晚期肺癌患者的5年生存率方面，現(xiàn)有的治療手段均面臨嚴峻的挑戰(zhàn)[17]。大量的臨床數(shù)據(jù)顯示[18]，肺癌患者死亡的主要原因是腫瘤細胞的靶器官侵襲以及惡性轉(zhuǎn)移。因此，研究肺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效可靠的治療靶點，為患者尋找安全的分子靶向治療方案，成為該領(lǐng)域的研究熱點。

研究顯示[19]，作為體內(nèi)重要的非編碼基因，miRNAs 參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、血管新生、化療耐藥以及侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。Guo等[20]研究證實miR-151a-5p、miR-23b 等多種miRNA在肺癌中表達異常，并影響腫瘤細胞的增殖與侵襲等。作為miR-302 家族中的一員，miR-302c 在肝癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，并引起廣泛關(guān)注[21]。Ma 等[22]研究表明miR-302c 靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-4（AP-4）基因的表達，抑制大腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及癌細胞轉(zhuǎn)移。Wang 等[23]研究證實miR-302c 抑制細胞周期蛋白cyclin O（CCNO）基因的表達從而誘導(dǎo)宮頸鱗狀細胞癌的凋亡。本研究中通過對在線生物信息數(shù)據(jù)集GSE1994 和GSE 136043 研究發(fā)現(xiàn)，miR-302c 在肺癌中存在低表達的現(xiàn)象，并且miR-302c 在肺癌中的表達與患者的預(yù)后以及惡性轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；細胞實驗顯示，過表達miR-302c 后，A549 細胞超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重，細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力以及血管新生能力明顯下降。

有研究[24]顯示，腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是肺癌發(fā)展中的重要的環(huán)節(jié)，腫瘤血管新生是癌細胞進行侵襲和轉(zhuǎn)移的主要途徑。Ramadan 等[25]研究指出，眾多信號通路與靶基因參與或調(diào)控腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程。CREB1 是細胞內(nèi)功能明確的促癌基因。Hu 等[26]研究顯示，在乳腺癌中抑制CREB1 的表達能明顯抑制乳腺癌細胞的體內(nèi)生長與靶器官轉(zhuǎn)移。Cheng 等[27]研究顯示CREB1 高表達的結(jié)腸癌患者的預(yù)后不佳，并且發(fā)生多處靶器官的轉(zhuǎn)移。本研究通過對Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行研究顯示，CREB1 在肺癌中處于高表達的狀態(tài)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與正常肺組織細胞相比，在A549 細胞中miR-302c 的表達明顯下降，CREB1 的mRNA 表達明顯升高，驗證了數(shù)據(jù)庫的研究結(jié)果。雙熒光素酶結(jié)果顯示miR-302c 能靶向調(diào)控CREB1 的表達。

揭示靶基因的作用位點，能更深入地闡明腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲的分子機制。P53 信號是細胞內(nèi)重要的抑癌通路，Lacroix 等[28]研究顯示該通路中的P53、P21 經(jīng)磷酸化后具有生物活性，并廣泛影響腫瘤細胞的代謝、增殖、細胞周期以及轉(zhuǎn)移與侵襲等生理病理過程。Vennin 等[29]研究指出P53 信號通過調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動P21 等相關(guān)抑癌分子的磷酸化，抑制胰腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Wang 等[30]研究顯示，在前列腺癌中，CREB1 能調(diào)控P53 的活性，抑制腫瘤細胞的血管生成。本研究結(jié)果顯示，P53 與靶基因CREB1 存在特異性結(jié)合位點。Western blot 結(jié)果顯示實驗組細胞CREB1 的表達明顯下降，p-P53、p-P21 的表達明顯升高。

綜合上述，miR-302c 在肺癌組織表達降低，過表達miR-302c 后能明顯抑制肺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，這可能與抑制靶基因CREB1 的表達以及P53 信號激活有關(guān)。但miR-302c 在肺癌臨床治療的價值尚需更深入的研究。