香茅醛對(duì)銅綠假單胞菌PAO1群體感應(yīng)的抑制活性研究

曾桃花, 李文茹, 謝小保, 施慶珊 張建設(shè)

香茅醛對(duì)銅綠假單胞菌PAO1群體感應(yīng)的抑制活性研究

曾桃花1,2, 李文茹2,*, 謝小保2,*, 施慶珊2, 張建設(shè)1

1. 浙江海洋大學(xué), 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 舟山 316022 2. 廣東省科學(xué)院微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070

多種植物精油及其活性成分被證明具有群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)抑制活性, 可以通過(guò)抑制病原菌的QS系統(tǒng), 減弱甚至消除其毒性和致病性。探究香茅醛對(duì)銅綠假單胞菌PAO1 QS系統(tǒng)的抑制活性, 研究香茅醛對(duì)QS調(diào)控的毒力基因和毒力因子的影響, 對(duì)揭示香茅醛的作用機(jī)制有一定科學(xué)意義。改變香茅醛處理PAO1細(xì)胞的濃度與時(shí)間, 觀察其生長(zhǎng)情況, 測(cè)定生物被膜、綠膿菌素、彈性蛋白酶、Pseudomonas quinolone signal(PQS)信號(hào)分子的產(chǎn)量, 以及用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)1.08 mg·mL-1香茅醛不抑制PAO1細(xì)胞的生長(zhǎng), 但是顯著下調(diào)了QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因、、、、、和相關(guān)毒力基因、、、、、、的表達(dá)。1.08 mg·mL-1香茅醛降低了PQS的產(chǎn)量, 對(duì)生物被膜的抑制率達(dá)到54.4%。2.15 mg·mL-1香茅醛使PAO1細(xì)胞培養(yǎng)5 h和24 h時(shí)的彈性蛋白酶產(chǎn)量分別減少84.1%和71.6%。0.27 mg·mL-1香茅醛輕微刺激綠膿菌素產(chǎn)生, 0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛減少綠膿菌素的產(chǎn)量?？傊? 香茅醛對(duì)PAO1具有高效的QS抑制活性, 能下調(diào)QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因的表達(dá)水平, 能抑制相關(guān)毒力因子的產(chǎn)生, 有潛能開(kāi)發(fā)為高效的群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors, QSI)。

香茅醛; 銅綠假單胞菌; 群體感應(yīng); 毒力因子; 生物被膜

0 前言

抗生素耐藥性和抗生素污染問(wèn)題日益嚴(yán)重, 新一代抗菌藥物的新靶標(biāo)研究受到廣泛關(guān)注[1–2]。研究發(fā)現(xiàn), QS系統(tǒng)可作為病原菌防治的新靶標(biāo)[3]。QS是細(xì)菌個(gè)體與個(gè)體之間的一種密度依賴性交流機(jī)制, 細(xì)菌合成一種被稱為自誘導(dǎo)物質(zhì)(autoinducer, AI)的信號(hào)分子, 并不斷向環(huán)境中釋放, AI隨著細(xì)菌密度的增加而累積, 當(dāng)累積到一定濃度閾值時(shí), AI可與信號(hào)分子受體蛋白結(jié)合并啟動(dòng)特定基因的表達(dá), 調(diào)控細(xì)菌的群體行為來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化, 如產(chǎn)生毒素、形成生物被膜和抗生素耐藥性等[4]。QSI可以抑制病原菌的毒力和致病力, 但對(duì)其生長(zhǎng)影響不大, 因而不會(huì)為耐藥菌提供有利的選擇壓力[5–6]。銅綠假單胞菌(, PA)是一種條件致病菌, 極易引起燒傷部位、呼吸道、尿道感染, 對(duì)健康人影響不大, 但會(huì)危及免疫功能低下患者和囊腫性纖維化患者的生命[7]。PA不僅會(huì)感染人體, 也會(huì)污染水源和食品, 在飲用水和食品中均檢出過(guò)此菌[8–9]。研究發(fā)現(xiàn), PA對(duì)大多數(shù)抗生素極易產(chǎn)生耐藥性, 很難用傳統(tǒng)抗菌藥物根除該菌[10–11]。PA生物被膜的形成和綠膿菌素、彈性蛋白酶等毒力因子的產(chǎn)生都受到其QS系統(tǒng)的調(diào)控, 可用QSI取代抗菌劑來(lái)降低其耐藥性[12–13]。QSI抗菌藥物的研究對(duì)解決PA等致病菌的耐藥性問(wèn)題具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外對(duì)QSI已有一定的研究, 最早發(fā)現(xiàn)天然來(lái)源的呋喃酮類和內(nèi)酯類化合物都有較強(qiáng)的QS抑制活性, 但是它們?cè)诋a(chǎn)物中含量低且有毒性, 難以廣泛投入使用[14–15]。為開(kāi)發(fā)高效低毒的QSI, 研究人員開(kāi)始對(duì)呋喃酮等天然QSI進(jìn)行化學(xué)修飾, 化學(xué)合成QSI[16–17]]。同時(shí)也在不斷尋找新型的天然QSI, 植物來(lái)源的QSI具備安全、低毒、環(huán)保等優(yōu)勢(shì), 是QSI抗菌藥物開(kāi)發(fā)的天然寶庫(kù), 研究發(fā)現(xiàn)從中草藥、生姜、大豆、大蒜、石榴和大葉黃楊中都能提取出QSI活性物質(zhì), 而且大多為萜類和黃酮類化合物, 如兒茶素、薄荷醇、6—姜酚等[18–21]。植物精油是從植物的花、葉、根、樹(shù)皮、果實(shí)、種子、樹(shù)脂等提煉而來(lái), 分子量低、安全、低毒且容易獲取, 而且多種精油及其活性成分被報(bào)道具有QS抑制活性, 精油類QSI的研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[22–24]。研究表明檸檬烯等多種單萜類精油化合物都能抑制PA的QS系統(tǒng)[25]。香茅醛(3, 7—二甲基—6—辛烯醛)也是一種單萜類化合物, 是香茅()油和桉()葉油的主要成分[26–27], 為一種無(wú)色至微黃色液體, 具有檸檬香氣和殺蟲(chóng)抑菌活性, 常用來(lái)制作香精、驅(qū)蟲(chóng)劑和防腐劑, 但暫無(wú)其在QS方面的研究[28–30]。

本研究通過(guò)檢測(cè)香茅醛對(duì)PAO1 QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因表達(dá)水平的影響, 以及對(duì)該菌PQS信號(hào)分子、生物被膜、彈性蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的影響, 研究香茅醛的QS抑制活性, 為新型PA防治藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、菌株、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

香茅醛, 純度為96%, 相對(duì)密度為0.86, 購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 銅綠假單胞菌PAO1由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所提供, 本實(shí)驗(yàn)室保存; LB液體培養(yǎng)基: 10 g·L-1胰蛋白胨, 5 g·L-1酵母粉, 10 g·L-1NaCl; PAO1在LB液體培養(yǎng)基中180 r·min-1、37℃恒溫振蕩培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銅綠假單胞菌菌懸液制備

參考文獻(xiàn)[26, 31–32]的方法, 將PAO1細(xì)胞在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 低速離心(4000 r·min-1, 5 min)培養(yǎng)液, 菌體用1×PBS洗滌并重懸, 稀釋至(1—2)×108cfu·mL-1, 備用。

1.2.2 生長(zhǎng)情況測(cè)定

在《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(第4版)中細(xì)菌生長(zhǎng)曲線制作方法的基礎(chǔ)上稍作修改, 比濁測(cè)定96孔板中PAO1細(xì)胞不同時(shí)間段的生長(zhǎng)情況[33]。將1.2.1中制備的1—2×108cfu·mL-1指數(shù)生長(zhǎng)期PAO1菌懸液1: 100加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中, 調(diào)整起始濃度為1—2×106cfu·mL-1, 處理組再加入不同濃度梯度的香茅醛, 設(shè)立空白對(duì)照組。取200 μL混合液到96孔板, 每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃持續(xù)振蕩培養(yǎng)72 h, Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀每隔1 h自動(dòng)檢測(cè)各孔的OD600值, 分析細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。香茅醛的濃度分別為0、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因的表達(dá)水平測(cè)定

在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入初始濃度為1—2×108cfu·mL-1的指數(shù)生長(zhǎng)期PAO1菌懸液和1.08 mg·mL-1的香茅醛, 對(duì)照組不加香茅醛, 設(shè)立3個(gè)平行。振蕩培養(yǎng)5 h后, 12000 r·min-1離心培養(yǎng)液, 收集菌體。按照說(shuō)明書(shū)的方法, 用Vazyme Bacteria RNA Extraction Kit從PAO1細(xì)胞中提取總RNA, 并用NanoDrop One超微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。使用PrimeScript RT Master Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用SYBR Green Mix進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng), 反應(yīng)分別在ETC811型基因擴(kuò)增儀和ABI QuantStudio 6熒光定量PCR儀上進(jìn)行。按照說(shuō)明書(shū)配制10 μL Real Time PCR反應(yīng)體系(2 × TB GreenII 5 μL; PCR Forward Primer 0.4 μL; PCR Reverse Primer 0.4 μL; ROX Reference Dye II 0.2 μL; cDNA 1 μL;滅菌水3 μL), 每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性30 s ; 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 34 s ,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。依據(jù)NCBI中已測(cè)序的PAO1相關(guān)基因序列, 用Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計(jì)和的基因引物, 引物序列分別為forward: 5′-CTGACAC GGGCTGGATT-3′,reverse: 5′-AGGCGGTTGC TGAAGAT-3′;forward: 5′-CCTTCGCCAACTC GTC-3′,reverse: 5′-TGTCGGTGCCGTCTTC- 3′。其他基因引物參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的引物序列, 以16S rRNA為內(nèi)參基因, 委托華大基因合成qPCR引物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 生物被膜測(cè)定

PAO1培養(yǎng)液處理方式同1.2.2, 把添加了混合液的96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h, 采用Li等[5]的方法分別測(cè)定加入0(對(duì)照組)、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛之后, PAO1生物被膜的相對(duì)含量。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中, 測(cè)OD600, 得到懸浮細(xì)胞濃度。然后將原96孔板用去離子水沖洗干凈并烘干, 0.1% (wt/vol)結(jié)晶紫染色10 min, 洗掉染色液, 烘干孔板, 之后加入95%的乙醇脫色, 測(cè)OD590。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 綠膿菌素測(cè)定

在100 mL LB液體培養(yǎng)基中接入(1—2)×106cfu·mL-1的指數(shù)生長(zhǎng)期PAO1菌懸液, 處理組再加入香茅醛, 使其濃度分別為0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1, 陽(yáng)性對(duì)照組不添加香茅醛, 用去離子水作陰性對(duì)照。培養(yǎng)液37 ℃, 180 r·min-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)7 d, 每隔24 h取5 mL培養(yǎng)液提取綠膿菌素。離心培養(yǎng)液, 取上清, 加入3 mL氯仿抽提綠膿菌素, 并用1 mL 0.2 N HCl反萃取氯仿中的綠膿菌素, HCl層溶液變?yōu)榧t色至深紅色, 測(cè)其OD520值, 上清液中綠膿菌素的濃度為(μg·mL-1): OD520×17.072[34]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 彈性蛋白酶活性測(cè)定

將(1—2)×108cfu·mL-1指數(shù)生長(zhǎng)期PAO1細(xì)胞接種到100 mL LB中, 37 ℃, 180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng), 分別測(cè)定培養(yǎng)5 h和24 h時(shí)PAO1的彈性蛋白酶活性。處理組分別加入0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛, 陰性對(duì)照組用LB培養(yǎng)基提取彈性蛋白酶, 不接種PAO1細(xì)胞也不加入香茅醛。離心取0.5 mL上清, 加入10 mg彈性蛋白—?jiǎng)偣t作為底物和1 mL緩沖液(30 mM Tris-HCl buffer, PH 7.2), 37℃振蕩反應(yīng)6 h。加入50 μL 0.12 M的乙二胺四乙酸(EDTA)終止反應(yīng), 離心取上清, 測(cè)OD495值[35]。彈性蛋白—?jiǎng)偣t被彈性蛋白酶分解后釋放出紅色物質(zhì)并溶解在緩沖液中, 在495 nm處有最大吸光度, 可以反應(yīng)彈性蛋白酶的活性大小[36]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 信號(hào)分子PQS產(chǎn)量測(cè)定

PAO1細(xì)胞的培養(yǎng)方式和香茅醛處理方法同1.2.3基因表達(dá)水平測(cè)定, 培養(yǎng)液在37 ℃, 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h, 每隔24 h, 12000 × g離心培養(yǎng)液5 min, 并收集上清。在20 mL上清液中加入60 mL乙酸乙酯, 渦旋2 min, 使上清與乙酸乙酯充分接觸。12000 × g離心上清與乙酸乙酯混合液5 min, 使之分層。將50 mL乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)瓶, 旋蒸, 直至旋轉(zhuǎn)瓶完全干燥, 加入1 mL混合液(酸化乙酸乙酯: 乙腈=1:1)重懸PQS。0.22 μm濾膜過(guò)濾PQS重懸液, 進(jìn)行HPLC分析, 采用Shim-pack GIST C18柱 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), 流動(dòng)相為甲醇—水(90:10 vol/vol), 流速為1 mL·min-1, 檢測(cè)339 nm處的波長(zhǎng)[6, 37–38]。繪制PQS標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的關(guān)系圖, 生成標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)樣品峰面積, 計(jì)算出樣品中PQS的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用軟件IBM SPSS Statistics 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)(student'stest), 分析各處理組與對(duì)照組之間的差異,<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 香茅醛對(duì)PAO1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖1為不同濃度香茅醛處理PAO1細(xì)胞之后, 用OD600值繪制的生長(zhǎng)曲線, 從圖中可看出香茅醛對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響很小。在培養(yǎng)約36個(gè)小時(shí)之后, 0.27、0.54、1.08 mg·mL-1香茅醛處理組的培養(yǎng)液吸光值均略高于對(duì)照組, 此現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與低劑量興奮效應(yīng)相關(guān)[39]。隨著香茅醛作用時(shí)間增加, 香茅醛有所消耗, 少量的香茅醛反而刺激了細(xì)菌增殖。從圖1中可看出這種低劑量興奮效應(yīng)并不明顯, 而且出現(xiàn)在細(xì)菌衰亡階段。因此, 香茅醛不會(huì)抑制PAO1細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.2 香茅醛對(duì)PAO1群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因表達(dá)水平的影響

1.08 mg·mL-1香茅醛處理PAO1細(xì)胞之后, 相較于對(duì)照組, PA QS系統(tǒng)的關(guān)鍵基因和相關(guān)毒力基因表達(dá)水平的變化情況見(jiàn)圖2。如圖2所示, 共研究了包括QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因、、、、、和相關(guān)毒力基因、、、、、、在內(nèi)的13個(gè)基因, 發(fā)現(xiàn)PAO1細(xì)胞經(jīng)香茅醛處理后, 所有基因的表達(dá)水平都不同程度下調(diào), 而且下調(diào)倍數(shù)都大于2,、、、下調(diào)尤其明顯。

圖1 不同濃度香茅醛處理下的銅綠假單胞菌PAO1生長(zhǎng)曲線

Figure 1 The growth curve ofPAO1 treated with different concentrations of citronellal

注: *表示與對(duì)照組相比有顯著差異, **表示與對(duì)照組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 2 Effect of citronellal on the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems ofPAO1

2.3 香茅醛對(duì)PAO1生物被膜的影響

細(xì)菌靜置培養(yǎng)后, 在96孔板內(nèi)壁形成一圈薄膜, 可以通過(guò)結(jié)晶紫染色法, 根據(jù)OD590值測(cè)定生物被膜的相對(duì)含量。培養(yǎng)24 h后PAO1細(xì)胞生物被膜的形成量如圖3所示, 隨著香茅醛濃度的增加, 生物被膜的形成量顯著減少。處理組對(duì)PAO1生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1處理組對(duì)生物被膜的抑制率最高, 為54.4%, 但香茅醛對(duì)懸浮細(xì)胞濃度的影響很小。

注: OD600表示菌懸液濃度, OD590表示生物被膜相對(duì)含量。*表示與對(duì)照組相比有顯著差異, **表示與對(duì)照組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 3 Effect of citronellal onPAO1 biofilm

2.4 香茅醛對(duì)PAO1綠膿菌素的影響

綠膿菌素的產(chǎn)量結(jié)果如圖4所示, 從圖4(A)可以看出, 在細(xì)菌培養(yǎng)的7 d中, 綠膿菌素產(chǎn)量先呈上升趨勢(shì), 在第3或4 d達(dá)到最大值, 之后一直下降。細(xì)菌濃度在第1 d快速增加, 幾乎達(dá)到最大值, 接著小范圍內(nèi)波動(dòng)約0.5 d, 之后持續(xù)減少。0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛處理組, 7 d都抑制綠膿菌素的產(chǎn)生, 但是無(wú)濃度依賴性。PAO1細(xì)胞培養(yǎng)的前2 d綠膿菌素產(chǎn)量隨香茅醛濃度的增加而減少, 但2.15 mg·mL-1處理組的綠膿菌素產(chǎn)量從第3 d開(kāi)始高于1.08 mg·mL-1處理組, 1.08 mg·mL-1處理組的綠膿菌素產(chǎn)量從第4 d開(kāi)始高于0.54 mg·mL-1處理組。此現(xiàn)象與PAO1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的衰亡期相似, 香茅醛不斷消耗, 并呈現(xiàn)出低劑量興奮效應(yīng), 促進(jìn)細(xì)胞增殖, 產(chǎn)生綠膿菌素, 導(dǎo)致綠膿菌素產(chǎn)量與香茅醛處理濃度成正比。同樣受到低劑量興奮效應(yīng)的作用, 低濃度0.27 mg·mL-1香茅醛第1 d后就輕微刺激綠膿菌素產(chǎn)生。

總之, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛對(duì)PAO1綠膿菌素的抑制效果最好, 抑制率高且穩(wěn)定, 每天的抑制率都高于30%。在綠膿菌素產(chǎn)量最高的第3、4 d, 0.54 mg·mL-1香茅醛對(duì)綠膿菌素的抑制率分別為50.1%和46.7%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的抑制率分別為65.7%和40.2%。

2.5 香茅醛對(duì)PAO1彈性蛋白酶的影響

從圖5可以看出, 不同濃度香茅醛處理PAO1細(xì)胞后, LasB彈性蛋白酶的產(chǎn)量明顯減少。從圖5(A)可知, PAO1細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)的彈性蛋白酶產(chǎn)量為5 h時(shí)的數(shù)倍, 隨著香茅醛濃度增加, 彈性蛋白酶不斷減少。2.15 mg·mL-1香茅醛的抑制率最大, 5 h時(shí)為84.1%, 24 h為71.6%?？梢?jiàn)香茅醛可顯著抑制PAO1產(chǎn)生彈性蛋白酶。

2.6 香茅醛對(duì)PAO1信號(hào)分子PQS產(chǎn)量的影響

用HPLC法測(cè)定PAO1的PQS信號(hào)分子產(chǎn)量, 結(jié)果如圖6所示。在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中, PQS產(chǎn)量逐漸增加, 培養(yǎng)72 h時(shí), PQS產(chǎn)量達(dá)到最大值。1.08 mg·mL-1香茅醛處理組在處理24、48和72 h時(shí)的PQS產(chǎn)量與對(duì)照組相比, 均有不同程度的降低, 分別降低了82.0%、82.3%和35.3%。

注: (A)PAO1細(xì)胞培養(yǎng)7天中的綠膿菌素的濃度; (B)PAO1細(xì)胞培養(yǎng)第3、4天的菌懸液。

Figure 4 Effect of citronellal onPAO1 pyocyanin

注: (A)OD495反應(yīng)彈性蛋白酶活性; (B)彈性蛋白酶分解彈性蛋白—?jiǎng)偣t并釋放出紅色物質(zhì); *表示與0 mg·mL-1組相比有顯著差異, **表示與0 mg·mL-1組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 5 Effect of citronellal onPAO1 elastase LasB

圖6 香茅醛對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的 PQS信號(hào)分子產(chǎn)量的影響

Figure 6 Effect of citronellal onPAO1 PQS molecules

3 討論

本研究分別用0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1的香茅醛處理PAO1細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)香茅醛在不抑制PAO1細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下, 能抑制PAO1的QS活性。這與之前QSI的相關(guān)研究結(jié)果一致, Rasmussen等[40]表示QS系統(tǒng)不直接參與細(xì)菌生長(zhǎng)的必需過(guò)程, 因此QSI不抑制或輕微抑制細(xì)菌的生長(zhǎng), 不會(huì)給耐藥菌提供有利的選擇壓力。Husain等[19]表明亞抑菌濃度(sub-MICs)下的薄荷()油和薄荷醇能干擾N—?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)。Li等[5]的研究也表明大蒜()精油中的二烯丙基二硫醚可以抑制PA產(chǎn)生毒力因子, 但對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)影響。PA至少包含、、三種QS系統(tǒng), 并呈現(xiàn)出級(jí)聯(lián)調(diào)控特點(diǎn),系統(tǒng)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂層, 正向調(diào)控和系統(tǒng),系統(tǒng)起連接作用,正向調(diào)控系統(tǒng), 并受系統(tǒng)的反向調(diào)節(jié)[41]。系統(tǒng)包含N-(3-oxododecanoyl)- L-homoserine lactone(3OC12- HSL)信號(hào)分子合成酶LasI和信號(hào)分子受體蛋白LasR, 分別由和編碼[41–43], 香茅醛處理使和的表達(dá)量都顯著下調(diào), 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香茅醛抑制了系統(tǒng)中3OC12-HSL信號(hào)分子合成酶和信號(hào)分子受體蛋白編碼基因的表達(dá)。和是系統(tǒng)的關(guān)鍵基因, 分別負(fù)責(zé)編碼N-butyryl-L-homoserine lactone(C4- HSL)信號(hào)分子合成酶RhlI和信號(hào)分子受體蛋白R(shí)hlR[41, 44–45]。香茅醛處理使和的表達(dá)水平均不同程度的下調(diào), 香茅醛抑制了系統(tǒng)C4-HSL信號(hào)分子合成酶和信號(hào)分子受體蛋白編碼基因的表達(dá)。、和編碼PQS信號(hào)分子的合成, PQS與編碼的信號(hào)分子受體蛋白PqsR結(jié)合, 調(diào)控PA的生物被膜、綠膿菌素和彈性蛋白酶[46–47]。香茅醛處理組的和表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組, 香茅醛抑制了PQS信號(hào)分子合成酶和受體蛋白編碼基因的表達(dá), 與基因表達(dá)水平下調(diào)一致, PQS的產(chǎn)量也顯著降低。以上結(jié)果表明, 香茅醛對(duì)PAO1的三種QS系統(tǒng)均有明顯的抑制作用, 香茅醛的QS抑制機(jī)制很可能是通過(guò)抑制信號(hào)分子合成酶的活性, 進(jìn)而抑制信號(hào)分子的合成, 干擾QS通路的正常生理功能。PAO1細(xì)胞經(jīng)香茅醛處理后, 其QS系統(tǒng)調(diào)控的毒力基因、、、、、和的表達(dá)水平也都顯著下調(diào), 它們分別負(fù)責(zé)不同毒力因子的合成:(LasA蛋白酶)[41]、(LasB彈性蛋白酶)[41]、(胞外多糖合成酶)[48],(綠膿菌素)[41],(外毒素A)[41],(幾丁質(zhì)酶)[49],(LecB凝集素)[50]。香茅醛處理不僅使PAO1 QS系統(tǒng)調(diào)控的毒力基因表達(dá)水平下調(diào), 也減少了相關(guān)毒力因子的產(chǎn)生, 生物被膜、綠膿菌素、彈性蛋白酶都受到香茅醛的抑制作用。

PA生物被膜難以根除, 極易引起持續(xù)性感染, 是該菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一[51]。Pontes等[52]發(fā)現(xiàn)香茅精油及其主要成分香葉醇能抑制金黃色葡萄球菌()的生物被膜形成。Cunha等[53]也表示稀釋之后的香茅精油對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌()有較低的細(xì)胞毒性, 但有較強(qiáng)的生物被膜抑制作用。本研究用香茅精油的主要成分香茅醛處理PAO1細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)香茅醛對(duì)PAO1具有較好的生物被膜抑制效應(yīng), 香茅醛處理組對(duì)生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的生物被膜抑制率高達(dá)到54.4%。雖然香茅醛同香茅精油和香葉醇一樣, 能抑制細(xì)菌生物被膜形成, 但香茅醛對(duì)革蘭氏陰性菌PAO1無(wú)殺菌作用, 而香茅精油和香葉醇對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的殺菌作用[52–53]。此現(xiàn)象與Trombetta等[54]發(fā)現(xiàn)單萜類化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌作用比對(duì)革蘭氏陰性菌強(qiáng)的結(jié)論一致。綠膿菌素、彈性蛋白酶都是由PA的QS系統(tǒng)調(diào)控的, 是該菌的重要毒力因子[55]。研究表明咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸和香草酸等多種植物的提取物都能抑制PA綠膿菌素的產(chǎn)生[56]。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度香茅醛處理PAO1細(xì)胞后, 7 d內(nèi)的綠膿菌素含量的變化情況, 發(fā)現(xiàn)0.54、1.08和2.15 mg·mL-1的香茅醛連續(xù)7 d減少了綠膿菌素的產(chǎn)量, 而且抑制率都高于30%, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛作用效果最強(qiáng)。LasB彈性蛋白酶主要受系統(tǒng)和基因的調(diào)控[41]。香茅醛抑制了PAO1的系統(tǒng), 下調(diào)了的表達(dá)水平, PAO1細(xì)胞培養(yǎng)5 h和24 h時(shí)彈性蛋白酶的產(chǎn)量, 分別減少了84.1%和71.6%。

目前QSI研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段, 受試菌株基本生長(zhǎng)于培養(yǎng)基, 生長(zhǎng)條件比較單一, QSI是否能降低病原菌的感染受到關(guān)注?？讜x亮等[57]用PAO1菌株感染大鼠腹腔, 相較于PAO1野生菌株, Δ和Δ雙突變體PAO1菌株(QS系統(tǒng)缺陷)的生物被膜形成能力大大降低, 大鼠的局部炎性反應(yīng)減弱, 表明PAO1感染動(dòng)物后, 與培養(yǎng)基中的PAO1一樣, 其毒力因子的產(chǎn)生受QS系統(tǒng)調(diào)控, 而且感染能力與毒力基因的表達(dá)水平成正比。Haripriyan等[58-59]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油能抑制PAO1 QS系統(tǒng)毒力基因的表達(dá), 并且能減弱PAO1對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒力。QSI在治療細(xì)菌感染方面存在較大潛力, QSI, 尤其是香茅醛這類天然低毒的QSI研究對(duì)解決抗生素耐藥性問(wèn)題具有重要意義。

4 結(jié)論

綜上, 香茅醛通過(guò)下調(diào)QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因、、、、、和相關(guān)毒力基因、、、、、、的表達(dá)水平, 抑制了QS系統(tǒng)信號(hào)分子的合成, 從而抑制了QS通路的正常生理功能, 抑制了銅綠假單胞菌PAO1菌株的生物被膜形成, 并抑制了該菌綠膿菌素和彈性蛋白酶的產(chǎn)生。香茅醛對(duì)PAO1有較強(qiáng)的QS抑制活性, 又具備植物精油的低分子量、安全性、低毒性且容易獲取等特點(diǎn), 而且目前尚無(wú)此化合物在QS方面的研究, 說(shuō)明香茅醛在PAO1的防治及在天然QSI抗菌藥物的研發(fā)方面都有重要意義。

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Quorum sensing inhibitory activity ofPAO1 by citronellal

ZENG Taohua1,2, LI Wenru2,*, XIE Xiaobao2,*, SHI Qingshan2, ZHANG Jianshe1

1. National Engineering Research Center for Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou 510070, China

Various essential oils and their effective components have quorum sensing (QS) inhibitory activity. They reduced or even eliminated the pathogen's virulence and pathogenicity by targeting theirQS systems. The aim of this study is to explore the QS inhibitory activity ofPAO1 by citronellal, and to study the effects of citronellal on the virulence genes and virulence factors regulated by the QS systems. This study is of scientific significance to revealing the action mechanism of citronellal. The growth inhibition, biofilm, pyocyanin, elastase, and PQS molecules of the PAO1 straintreated by different concentrations of citronellal were determined in different time. The expression levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes in the PAO1 strain treated by citronellal were analyzed by qRT-PCR. This study found that 1.08 mg·mL-1citronellal did not inhibit the growth of PAO1 cells, but significantly down-regulated the expression of the key genes in the QS systems (,,,,,) and the related virulence genes regulated by the QS systems (,,,,,,). PQS molecules were reduced significantly with 1.08 mg·mL-1citronellal. The inhibition rate of biofilm production was 54.4% by 1.08 mg·mL-1citronellal. The yield of elastase was reduced by 84.1% and 71.6% with 2.15 mg·mL-1citronellal when PAO1 cells were cultured for 5 h and 24 h respectively. The production of pyocyanin was slightly stimulated by 0.27 mg·mL-1citronellal, and reduced by 0.54, 1.08 and 2.15 mg·mL-1citronellal. In short, citronellal had a highly effective QS inhibitory activity against PAO1. Citronellal significantly inhibited the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems of the PAO1 strain. Moreover, the related virulence factors regulated by the QS systems were reduced after citronella treatment. Therefore, citronellal has potential to be developed as a QS inhibitor against.

citronellal;; quorum sensing; virulence factors; biofilm

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10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.004

Q939.92

A

1008-8873(2021)04-027-09

2020-12-06;

2021-01-15

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2020A1515010850, 2021A1515011080)

曾桃花(1995—), 女, 江西贛州人, 碩士研究生, 主要從事微生物學(xué)研究, E-mail: 1879485675@qq.com

李文茹, 女, 博士, 研究員, 主要從事有害微生物防控研究, E-mail: liwenru@gdim.cn

謝小保, 男, 碩士, 研究員, 主要從事有害微生物防控研究, E-mail: xiaobaoxie@126.com