EPL/PCL/HA復(fù)合支架修復(fù)兔顱骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究*

田彬 江青松 張振庭

由腫瘤、外傷、先天性畸形以及老年性骨質(zhì)疏松等導(dǎo)致的骨組織缺損，是發(fā)生于顱頜面部的常見問題［1］。骨組織缺陷的修復(fù)與重建主要依賴于骨移植替代材料。隨著組織工程各學(xué)科的發(fā)展，人工合成骨替代材料逐漸得到臨床的認(rèn)可?？谇活M面部由于存在與外界相通的竇腔的解剖特點(diǎn)，增加了骨移植術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，骨組織工程學(xué)的研究集中于開發(fā)可以預(yù)防潛在感染風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)具有良好的成骨能力的理想的骨組織工程材料［2］。

ε-多聚賴氨酸（ε-poly-lysine，EPL）是由鏈霉菌天然產(chǎn)生的陽離子多肽［3］。它易溶于水，可以分解為賴氨酸或胺，酰胺，羥基或羧基，從而促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長［4］。重要的是，EPL具有廣譜的抗菌活性，可生物降解，并且對人類無毒［5］，因而被廣泛應(yīng)用于食物防腐、制藥、材料表面改性及基礎(chǔ)研究細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域。但以往的文獻(xiàn)報(bào)道中并未見將EPL應(yīng)用于骨組織工程復(fù)合支架的研究報(bào)道。

我們前期的研究已通過FDM-3D（熔融沉積成型-3D）打印技術(shù)成功構(gòu)建了具有EPL涂層的3D結(jié)構(gòu)納米級聚己內(nèi)酯/羥基磷灰石（EPL/PCL/HA）復(fù)合支架［6］。前期的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EPL涂層的3D結(jié)構(gòu)EPL/PCL/HA支架具有抗菌性能，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化。然而，EPL/PCL/HA支架的動物體內(nèi)骨缺損修復(fù)作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)將EPL/PCL/HA復(fù)合支架植入兔顱骨臨界骨缺損模型，觀察其在體內(nèi)是否可以促進(jìn)骨缺損的成骨。

1.材料與方法

1.1 主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器和動物 納米羥基磷灰石（HA）（昆山華僑科技新材料有限公司），聚己內(nèi)酯（PCL）（深圳市易生新材料有限公司），ε-多聚賴氨酸（EPL）（鄭州拜納佛生物工程有限公司）。OLYMPUS倒置光學(xué)/熒光顯微鏡（OLYMPUS BX61，日本)，種植機(jī)（諾瓦格MD20）。

20只雄性4-6月齡，體重3.0±0.5千克的普通級新西蘭白兔，實(shí)驗(yàn)動物的使用已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院研究所實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過（倫理號：KQYY-201803-002）。

1.2 PCL支 架、PCL/HA復(fù) 合 支 架 及EPL/PCL/HA復(fù)合支架的制備3D PCL支架和3D PCL/HA復(fù)合支架由江陰瑞康健生物醫(yī)學(xué)科技有限公司通過自行開發(fā)的熔融沉積成型儀打印制作而成［6］。簡要步驟如下：

PCL/HA支架采用聚己內(nèi)酯與羥基磷灰石（PCL和HA混合比例7∶3）為原材料，攪拌器攪拌均勻混合，然后使用熔融沉積建模（FDM）系統(tǒng)構(gòu)建PCL/HA支架。計(jì)算機(jī)編寫相關(guān)程序設(shè)定參數(shù)后，微型擠出機(jī)系統(tǒng)通過沉積噴嘴以熔融形式輸出PCL/HA支架，制成直徑為300μm，間距為450μm的3D支架。PCL支架僅用PCL作為原材料打印。支架打印完成后鈷60輻照滅菌，密封包裝備用。

將PCL/HA支架浸入5mg/ml EPL溶液（EPL溶于無菌去離子水，制成濃度為5mg/ml的EPL水溶液），24小時(shí)后，吸出溶液。支架在無菌干燥箱中干燥，完成EPL/PCL/HA支架的制備。并密封于無菌存儲器中備用。

1.3 支架的動物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn) 將舒泰10mg/kg和速新眠II 0.2ml/kg混合后肌肉注射，全身麻醉實(shí)驗(yàn)兔。麻醉起效后，顱頂區(qū)備皮，消毒，鋪巾。沿顱中線做4cm矢狀切口，剝離皮下組織及骨膜，暴露骨面。在低速旋轉(zhuǎn)和大量生理鹽水冷卻下，顱頂區(qū)制備四個(gè)圓形直徑6mm的全層骨缺損。骨缺損中心點(diǎn)距中縫5mm連線，與中縫交點(diǎn)處球鉆制備凹坑至松質(zhì)骨層，填入金屬釘做參考標(biāo)記點(diǎn)（方便以后結(jié)果測量及分析時(shí)骨缺損中心點(diǎn)的確定）。然后以四個(gè)中心點(diǎn)為標(biāo)志使用外徑為6mm的取骨環(huán)鉆制備四個(gè)圓形全層骨缺損，保證下方硬腦膜完整。骨缺損分為四組：1.BC，空白對照組；2.PCL組；3.PCL/HA組；4.EPL/PCL/HA組。根據(jù)分組填充對應(yīng)的復(fù)合支架，空白對照組不填入任何材料，僅以新鮮出血形成的血凝塊充盈骨缺損（圖1）。沒有使用額外膜覆蓋。嚴(yán)密對位縫合術(shù)區(qū)骨膜，分層縫合皮下組織和皮膚。消毒皮膚。在手術(shù)后即刻和手術(shù)后48h內(nèi)肌肉注射青霉素（10萬U/kg），并密切觀察頭顱手術(shù)區(qū)恢復(fù)情況。

圖1 兔顱骨制備4個(gè)6 mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，填入不同成骨材料示意圖及手術(shù)過程圖。

1.4 熒光標(biāo)記及標(biāo)本制取 動物處死前13、14天耳緣靜脈注射10mg/ml鈣黃綠素?zé)晒庾⑸湟?，動物處死?、4d耳緣靜脈注射10mg/ml茜素紅熒光注射液。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為2組，每組10只，分別于術(shù)后4周、8周處死，取顱頂骨標(biāo)本。

1.5 影相學(xué)檢測 顱骨標(biāo)本，大體觀察完成后，常規(guī)固定，通過微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT：Siemens Inveon Micro，德國）系統(tǒng)對其進(jìn)行360度旋轉(zhuǎn)掃描。數(shù)據(jù)在Micro-CT自帶軟件中進(jìn)行三維重建，觀察骨缺損的愈合情況。

1.6 脫鈣標(biāo)本組織學(xué)切片及不脫鈣磨片的制取 經(jīng)過缺損中心分切標(biāo)本，平均分成2份。一份行脫鈣處理，切片行HE染色及Masson染色；另一份行脫水處理，制備硬組織磨片。標(biāo)本在共聚焦顯微鏡下觀察鈣黃綠素、茜素紅相應(yīng)的激發(fā)熒光，分別觀察到綠色和紅色的自發(fā)熒光，采集圖像。然后，用甲苯胺藍(lán)對磨片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察并拍片。確定以下組織形態(tài)學(xué)參數(shù)：新骨面積比（%）=（新形成的骨面積，mm2）/（總面積，mm2）×100（%）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)方法采用ANOVA單因素方差分析比較各組間及組內(nèi)差異，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 術(shù)后觀察及標(biāo)本大體觀察 所有手術(shù)均順利完成，頭顱傷口恢復(fù)良好，手術(shù)區(qū)域未出現(xiàn)感染、及傷口裂開等并發(fā)癥，無一例動物死亡，均可參加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

所取標(biāo)本肉眼觀察均可見骨缺損處覆蓋纖維軟組織，如圖2所示。術(shù)后4周標(biāo)本，觸摸骨缺損處，所有空白對照組的骨缺損處組織都較軟，邊緣清晰；放置支架組較空白對照組略硬，邊界模糊。術(shù)后8周，空白對照組，觸摸較軟，邊界變模糊。PCL組骨缺損處支架材料變軟，骨缺損處邊界不明顯。PCL/HA組和EPL/PCL/HA組骨缺損處無明確邊界，缺損區(qū)質(zhì)地較硬。

圖2 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本大體觀

2.2 CT結(jié)果Micro-CT掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，結(jié)果見圖3。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Micro-CT分析中，骨體積分?jǐn)?shù)（BoneVolume/TotalVolume，BV/TV）表示骨組織體積與組織體積比值，可直接反應(yīng)骨量變化情況。用BV/TV對新生骨組織進(jìn)行定量分析，四周時(shí)，EPL/PCL/HA組和PCL/HA組中新生骨顯著多于PCL組及BC組，EPL/PCL/HA組與PCL/HA組差別不大。術(shù)后8周時(shí)，與4周相比，各組新生骨均有所增加，四組新生骨組織量均有顯著性差異，EPL/PCL/HA＞PCL/HA＞PCL＞BC，EPL/PCL/HA組中新生骨在所有組中是最多的（圖四）。

圖3 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本Micro-CT三維重建圖及骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）統(tǒng)計(jì)分析

2.3 脫鈣切片的組織形態(tài)學(xué)檢測（HE染色，Masson染色）HE染色和Masson染色用于評估缺損區(qū)域的骨再生情況。結(jié)果表明，新生的礦化組織為骨樣組織。在第4周，空白組和PCL組中從缺損周圍向中心的新形成的骨組織非常有限。在PCL/HA和EPL/PCL/HA組中檢測到更多的新骨形成，EPL/PCL/HA組有最多的新骨形成。當(dāng)植入時(shí)間延長至8周時(shí)，空白組僅形成了少量新骨，在放置支架的三組中均比4周對應(yīng)組有更多新形成的骨。在EPL/PCL/HA組中觀察到的新骨形成量最高，這表明EPL/PCL/HA支架具有強(qiáng)大的骨缺損修復(fù)能力（圖4，圖5）。

圖4 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本切片HE染色（×40）及新生骨組織面積的統(tǒng)計(jì)分析

圖5 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本切片Masson染色（×40）及新生骨組織面積的統(tǒng)計(jì)分析

2.4不脫鈣磨片的熒光檢測與組織形態(tài)學(xué)檢測

2.4.1 不脫鈣磨片的熒光檢測 在激光共聚焦顯微鏡下分別拍攝2種熒光條帶并獲得融合照片，新生骨組織螯合鈣黃綠素而呈現(xiàn)出亮綠色，螯合茜素紅而呈現(xiàn)為紅色。用Image J圖像分析軟件通過讀取熒光顯微鏡圖片的灰度值來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4周時(shí)，結(jié)果顯示BC組中沒有明顯的新生礦化物組織形成，而PCL、PCL/HA和EPL/PCL/HA組的缺損邊緣處形成了少量不規(guī)則和不對稱的新生礦化骨組織，并且支架的形狀得到了很好的維護(hù)（圖6 A，C，E，G），且沒有跡象顯示骨代用品的吸收或溶解。EPL/PCL/HA組和PCL/HA組中新生骨顯著多于PCL組及BC組，EPL/PCL/HA組與PCL/HA組差別不大。8周時(shí)，放置支架的三組中新生的礦化物組織形成的數(shù)量均顯著增加。支架材料的表面逐漸被新的礦物組織所替代（圖6 B，D，F(xiàn)，H）。數(shù)據(jù)分析顯示，在EPL/PCL/HA組中形成了新的礦物質(zhì)組織最多，隨后是PCL/HA和PCL組。最低的新礦物組織形成發(fā)生在BC組中（圖6）。

圖6 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本磨片熒光檢測（×40）及新生骨組織面積的統(tǒng)計(jì)分析

2.4.2 不脫鈣磨片的組織形態(tài)學(xué)檢測 如圖7所示，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明，骨缺損邊緣的新生骨組織被染成藍(lán)色，也有少量在骨缺損的中心區(qū)形成的新生骨組織被染成藍(lán)色。圖六的熒光染色中的亮綠色及紅色標(biāo)記與染色結(jié)果中新生骨組織位置基本一致。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，在兔顱骨骨缺損植入后第4和第8周，與空白組和PCL組相比，EPL/PCL/HA和PCL/HA組中出現(xiàn)了更多的新生礦物組織形成（圖7A-H）。此外，EPL/PCL/HA組中新礦化組織的百分比在第8周時(shí)顯著高于其他三組（圖7）。

圖7 手術(shù)后4周及8周的骨組織樣本磨片甲苯胺藍(lán)染色（×40）及新生骨組織面積的統(tǒng)計(jì)分析

3.討論

本研究通過熔融沉積成型（FDM）技術(shù)，將納米羥基磷灰石與聚己內(nèi)酯成功的制備了具有仿生多孔結(jié)構(gòu)的PCL/HA支架，然后在此基礎(chǔ)上負(fù)載ε-多聚賴氨酸，形成EPL/PCL/HA復(fù)合支架。課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，EPL/PCL/HA支架具有抗菌性能，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化［6］。本研究將支架運(yùn)用于兔顱骨骨缺損的修復(fù)，從大體解剖、影像學(xué)及組織病理學(xué)等方面觀察其動物體內(nèi)的促成骨能力，從而獲得一種具有潛在抗感染功能有具有骨誘導(dǎo)性的骨組織替代物的新型組織工程骨。

3.1 實(shí)驗(yàn)動物模型的選擇 兔的生長周期短，顱骨與頜骨的胚胎學(xué)的同源性，顱骨手術(shù)操作方便，可重復(fù)性好，因而兔顱骨缺損是研究顱頜面部骨缺損的動物模型中最為常用的。

對于兔顱骨的臨界骨缺損的尺寸有多種理論［7］，我們綜合各種觀點(diǎn)后進(jìn)行了前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選擇了以直徑6mm全層骨缺損做為本實(shí)驗(yàn)的動物模型。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在手術(shù)后4周和8周，空白對照組新生骨百分比均少于10%，反應(yīng)出我們采用制作的6mm圓形貫通顱骨缺損符合臨界骨缺損的要求。此外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行micro-CT、不脫鈣組織磨片的顯微熒光分析，以及多種的組織學(xué)評價(jià)結(jié)果分析，放置支架的三組骨缺損形成的新骨均明顯多于空白對照組。由此說明我們的組織工程支架對于骨缺損的修復(fù)是有明確意義的。

3.2 3D打印復(fù)合材料的優(yōu)勢 由單一組分加工而成的骨組織工程支架難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的臨床條件下的骨再生要求。近年來，學(xué)者們著力于將幾種組分材料通過簡單可行的方法復(fù)合，從而集中幾種材料的優(yōu)勢，形成的復(fù)合型支架材料，更好的促進(jìn)骨缺損的愈合。

羥基磷灰石是自然骨的主要無機(jī)部分，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性。但羥基磷灰石生物陶瓷脆性高、抗折強(qiáng)度低。聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）是一種人工高分子材料。PCL由于其生物可吸收性、力學(xué)性能優(yōu)良、熔點(diǎn)較低、低溫成型等，是優(yōu)秀的3D打印材料，因而常用作FDM技術(shù)制造材料。但是其機(jī)械強(qiáng)度低不能夠滿足骨組織工程支架的需求。本實(shí)驗(yàn)中，我們將羥基磷灰石與聚己內(nèi)酯以3∶7的比例混合，然后使用FDM技術(shù)進(jìn)行三維支架的打印，因而PCL/HA復(fù)合支架綜合了兩種材料的優(yōu)點(diǎn)。

支架材料影響支架的性能，而支架的結(jié)構(gòu)更是影響其成功的重要的因素。成功的支架取決于它的孔隙率、孔結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和其表面化學(xué)性質(zhì)［8］。支架需要具有高的孔隙率和貫穿性以支持細(xì)胞的黏附和增殖，同時(shí)方便營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的轉(zhuǎn)移［9］。傳統(tǒng)的支架制造方法包括粒子瀝濾法、溶劑澆鑄法、氣體誘導(dǎo)發(fā)泡法、纖維網(wǎng)格粘結(jié)法、溶液澆鑄法、階段分離法和冷凍干燥法等等［10］，這些傳統(tǒng)的支架制造方法制造的生物支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨機(jī)，不可控，批次之間無法形成統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)。熔融沉積成型（FDM）屬于快速成型技術(shù)，在3D打印技術(shù)的輔助下，對材料孔徑、孔隙率調(diào)控的同時(shí)將幾種材料融合整合了幾種成分材料的優(yōu)勢。本研究采用3D-FDM打印技術(shù)制備的PCL/HA支架保證了其多孔狀結(jié)構(gòu)，表面形態(tài)整齊，孔徑規(guī)整均勻，連通性好。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中4周及8周時(shí)，PCL/HA組及EPL/PCL/HA組均可觀察到缺損中心區(qū)域成骨，而空白對照組僅觀察到從骨缺損邊緣向中央方向開始形成新生骨，缺損中央未見新生骨。證明了本研究通過FDM技術(shù)打印的3D支架達(dá)到了組織工程支架的要求，有利于骨組織的細(xì)胞及血管向支架內(nèi)部生長，使缺損中心區(qū)域成骨。

對實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，4周時(shí)PCL/HA組與EPL/PCL/HA支架組新骨形成量沒有顯著性差異，但兩組明顯高于PCL組。此結(jié)果說明組織工程支架由于HA的加入對成骨有明顯的促進(jìn)作用。8周時(shí)PCL/HA組與EPL/PCL/HA支架組仍然明顯高于PCL，但這兩組間也存在顯著性差異，EPL/PCL/HA支架組明顯高于PCL/HA支架組。這個(gè)結(jié)果說明打印出的PCL/HA支架被EPL表面改性后，有抗菌功能的EPL的添加并沒有影響骨組織生長而是更加促進(jìn)了成骨。

3.3 EPL的促成骨作用 如何預(yù)防骨移植后造成手術(shù)失敗的最主要的原因——感染的發(fā)生，是材料學(xué)、組織工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域共同關(guān)注的難題。全身應(yīng)用抗生素存在感染位點(diǎn)藥物濃度低、用藥時(shí)間長、易產(chǎn)生抗藥性等缺點(diǎn)。因此，對于骨缺損修復(fù)的感染的控制，尋找既促進(jìn)成骨又有局部抗感染能力的骨替代物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

提高骨組織工程支架的骨傳導(dǎo)性的主要手段有對支架材料進(jìn)行表面改性，以增強(qiáng)其對細(xì)胞的親和力。在我們的研究中，用ε-多聚賴氨酸修飾PCL/HA支架，除了增加了支架的抗菌功能，同時(shí)達(dá)到對支架表面進(jìn)行改性的目的。先前的研究發(fā)現(xiàn)，EPL作用于細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)以及通過與核糖體結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，抑制細(xì)菌的呼吸作用，而具有抗菌功能。那么EPL的加入是否會影響骨缺損區(qū)域的成骨呢？

在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，4周時(shí)EPL/PCL/HA支架和PCL/HA支架促成骨作用相似，而8周時(shí)EPL/PCL/HA支架組新骨形成最多，促成骨作用最好?？梢哉f明EPL對支架表面的改性并沒有影響成骨。

EPL是一類可通過體內(nèi)的水解或酶解反應(yīng)最終降解為可被人體吸收的小分子氨基酸的可生物降解高分子聚合物，因而具有良好的生物相容性。EPL促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖的作用機(jī)制可能有幾點(diǎn)。1.通過EPL帶的陽離子與組織細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)的特異陰離子產(chǎn)生的的交聯(lián)作用，增加細(xì)胞與黏附表面的親和性。EPL能通過靜電吸引等作用，避免細(xì)胞聚集成球狀，使細(xì)胞在材料上黏附并鋪展為單層，明顯提高了三維條件下的細(xì)胞黏附效率［11］。2.EPL修飾過的PCL/HA支架表面親水性增強(qiáng)，表面正電荷增多，吸附組織液和血清中層的粘連蛋白和纖維粘連蛋白，容易保持支架的結(jié)構(gòu)［12］。3.EPL與細(xì)胞磷脂雙層有直接的相互作用，材料表面的活性提高了，從而增加細(xì)胞的黏附［13］。4.前期實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡高放大倍數(shù)下觀察到EPL/PCL/HA支架纖維表面呈微粗糙狀，說明經(jīng)EPL處理后支架表面變的粗糙，提高了細(xì)胞在材料上的黏附［6］。

通過實(shí)驗(yàn)證明我們制作的EPL/PCL/HA支架材料因?yàn)槠淞己玫暮暧^和微觀的三位孔隙結(jié)構(gòu)，表面改性后利于細(xì)胞粘附，組織再生，具有良好的生物相容性及促成骨性能。EPL/PCL/HA支架可以增強(qiáng)骨缺損的修復(fù)能力。我們的結(jié)果表明，EPL/PCL/HA是骨組織工程的有希望的替代品。

鑒于體內(nèi)研究的觀察時(shí)間較短，EPL/PCL/HA支架用于骨缺損的修復(fù)效果仍有待于更長觀察時(shí)間的評價(jià)，此外EPL對PCL/HA支架的表面改性的機(jī)理及促成骨機(jī)理也是該材料值得進(jìn)一步研究的方向。