枸杞根系內(nèi)生真菌的染色方法

陳思杰，李金，杜娟，賈寶森，顧沛雯

(寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

枸杞Lyciumbarbarum是茄科中唯一一屬鹽生植物,有悠久的栽培歷史,是國家衛(wèi)生部批準的藥食同源的中藥材之一,其果實枸杞子具有提高免疫、防衰老、抗氧化等多種功能[1].枸杞是寧夏的一張“紅色名片”,寧夏枸杞是唯一載入中國藥典的枸杞品種.明代藥學家李時珍在《本草綱目》中,將枸杞列為本經(jīng)上品,稱“全國入藥杞子,皆寧產(chǎn)也”.寧夏枸杞因其特殊的地理位置,藥用價值高于其他產(chǎn)地枸杞[2].但多年來因耕地面積限制,連作不可避免,進而引發(fā)連作障礙,土傳病害較為嚴重,尤其是枸杞根腐病發(fā)生較重,造成枸杞品質(zhì)下降,產(chǎn)量降低,嚴重時全株枯死,成為寧夏枸杞產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題之一.

植物內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性,分布在植物根、莖、葉等部位.現(xiàn)已有研究表明,根系內(nèi)生菌與植物共生后能改變根系分泌物的組分進而改善土壤微生物群落,有助于緩解連作障礙[3],同時能促進植物生長,提高植物的抗病能力[4].叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi,AMF)和深色有隔內(nèi)生真菌(dark seprate endophytes,DSE)均是植物根際廣泛分布的一類內(nèi)生真菌.AMF屬球囊霉門真菌,能夠與80%以上陸生高等植物根系形成菌根共生關(guān)系[5],這種共生關(guān)系通過提高宿主植物養(yǎng)分吸收和促進碳循環(huán)的方式改善宿主植物的生長[6],同時保護宿主植物免受各種土傳植物病原真菌、細菌和線蟲的侵害.DSE廣泛定殖于植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細胞內(nèi)或細胞間隙,形成深色、具橫膈的菌絲和腦狀、葉狀、鏈狀等形狀各異的微菌核結(jié)構(gòu)[7].自然條件下,DSE與AMF能共同在植物根系侵染定殖,具有促進植物生長,提高植物抗病性等功能[8],在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用.

根系內(nèi)生真菌的定殖主要通過染色法觀察.早在1970年,Phillips和Hayman[9]利用臺盼藍染色法研究菌根真菌定殖和侵入率測定.Muthukumar等[10]利用0.5 g/L臺盼藍染色法觀察5種不同植被類型的46科147種植物根系DSE和AMF的定殖,結(jié)果顯示74種植物根系被DSE和AMF共同侵染,并能清楚觀察到AMF和DSE的典型結(jié)構(gòu).王文彬等[11]利用酸性品紅染色法觀察西北荒漠油蒿根系,可見清晰的胞間菌絲和泡囊.唐燕等[12]用苯胺藍染色液對腋花杜鵑的根系進行染色,能清楚觀察到AMF和DSE的侵入,并能觀察到AMF菌絲、泡囊和DSE菌絲,但目前有關(guān)枸杞根系內(nèi)生真菌的定殖研究報道較少.本研究團隊前期用酸性品紅染色法觀察了不同品種枸杞根系DSE侵染狀況,能清楚觀察到DSE的結(jié)構(gòu)[13],但利用該染色方法觀測枸杞根系A(chǔ)MF的定殖時,染色效果較差,背景很深.這是由于取自田間的枸杞根樣多為多年生枸杞的主根及二級根,根系老化,呈棕褐色,沒有經(jīng)過脫色的根內(nèi)菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)雖然著色,但背景顏色較深,故菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)與背景顏色反差不大.本文針對枸杞根系老化、顏色較深的特點,探討理想的染色方法,為研究不同土壤類型的枸杞根系內(nèi)生真菌侵染定殖及生物學功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料和試劑

1.1.1 植物材料

枸杞根系采自寧夏森淼枸杞園.隨機選取長勢好的植株,去除落葉淺層土后,在距植株主干0～30 cm內(nèi)挖土壤刨面,采集根樣.選擇健康枸杞的根系作為實驗材料,清水沖洗后,選取直徑小于2 mm的須根置于FAA固定液(福爾馬林、冰醋酸、體積分數(shù)70%的酒精體積比為18∶1∶1)中,4 ℃保存.

1.1.2 染色劑

1)酸性品紅：0.05 g酸性品紅+20 mL甘油+60 mL乳酸+20mL蒸餾水；2)苯胺藍：0.5 g苯胺藍+100 mL無水乙醇;3)蘇丹紅Ⅳ：0.1 g蘇丹紅Ⅳ +10 mL 體積分數(shù)95%的酒精+10 mL甘油;4)臺盼藍：0.05 g臺盼藍+20 mL甘油+60 mL乳酸+20 mL蒸餾水);5)醋酸墨水：5 mL Quink牌墨水(上海派克筆有限公司)+ 95 mL 體積分數(shù)5%的冰醋酸.

1.1.3 其他試劑

100 g/L KOH,堿性H2O2,乳酸和甘油等.

1.2 研究方法

將保存于FAA固定液中的枸杞根系取出,流水沖去FAA固定液.將枸杞根系剪成1 cm的根段,置于6個離心管中,每個離心管40個根段,各加入100 g/L KOH完全浸泡根樣,90 ℃水浴90 min后倒去KOH溶液,自來水沖洗3次并控干水分.加入質(zhì)量分數(shù)30%的H2O2漂白5 min,同時軟化根系.脫色結(jié)束自來水沖洗并控干水分.加乳酸于室溫下酸化5 min,倒去乳酸.分別加入5種不同的染色液(①酸性品紅；②苯胺藍；③蘇丹紅Ⅳ；④臺盼藍；⑤醋酸墨水)于室溫染色3～5 min后,倒去染色液,染色液⑤染色后的根樣在清水中浸泡,染色液①～⑤染色后的根段浸泡在乳酸甘油(乳酸、甘油體積比為1∶1)中,室溫下過夜脫色.隨機取25個根段,平行放置于載玻片上,蓋上蓋玻片,適當輕壓,觀察并統(tǒng)計AMF和DSE的定殖率.

定殖率=受侵染的根段數(shù)/總鏡檢的根段數(shù)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性品紅染色

酸性品紅能將根系內(nèi)AMF菌絲和泡囊染上色(圖1a-b),同時能觀察到DSE菌絲(圖1c),但是背景褪色不明顯,導致根皮層細胞也被染上與菌絲、泡囊相近的顏色,染色清晰度不高,且毒性較大,不利于長期使用.

a.AMF菌絲；b.AMF菌絲和泡囊；c.DSE菌絲.圖1 枸杞根系內(nèi)生真菌酸性品紅染色Fig.1 Endophytic fungi in Lycium barbarum roots dyed with acid fuchsin

2.2 苯胺藍染色

苯胺藍染色后的背景為深藍色,和AMF菌絲(圖2a)、泡囊(圖2b-c)顏色相近,幾乎無法區(qū)分,根系內(nèi)的雜質(zhì)也多被染成藍色,不利于實驗的觀察.能觀察到DSE胞間菌絲(圖2d),而且苯胺藍為致癌疑似物,對身體的傷害較大,不利于長期使用.

a.AMF菌絲；b-c.AMF泡囊；d.DSE菌絲.圖2 枸杞根系內(nèi)生真菌苯胺藍染色Fig.2 Endophytic fungi in Lycium barbarum roots dyed with aniline blue

2.3 蘇丹紅Ⅳ染色

用蘇丹紅Ⅳ染色操作簡單,AMF菌絲著色淡(圖3a),但可清晰觀察到深紅色的AMF不規(guī)則形泡囊(圖3b)和根內(nèi)孢子(圖3c).由于褪色干凈,可觀察到DSE淺褐色有隔菌絲(圖3d)和帶狀微菌核(圖3e),但蘇丹紅Ⅳ有疑似致癌作用,也不利于長期使用.

a.AMF菌絲；b.AMF泡囊；c.AMF根內(nèi)孢子；d.DSE菌絲；e.DSE微菌核.圖3 枸杞根系內(nèi)生真菌蘇丹紅Ⅳ染色Fig.3 Endophytic fungi in Lycium barbarum roots dyed with Sudan Ⅳ

2.4 臺盼藍染色

經(jīng)臺盼藍染色后,枸杞根內(nèi)AMF菌絲和泡囊著深藍色(圖4a-e).AMF泡囊外輪廓清晰,可見其內(nèi)含物(圖4e)及AMF根內(nèi)孢子(圖4f).但是由于根皮層組織也染上了相近的顏色,與背景反差較小,可觀察到DSE典型結(jié)構(gòu)菌絲(圖4g-h)和微菌核(圖4i).但臺盼藍為致癌疑似物,對身體的傷害較大,不利于長期使用.

a-c.AMF菌絲；d.AMF菌絲和泡囊；e.AMF泡囊；f.AMF根內(nèi)孢子；g-h.DSE菌絲；i.DSE微菌核.圖4 枸杞根系內(nèi)生真菌臺盼藍染色Fig.4 Endophytic fungi in Lycium barbarum roots dyed with trypan blue

2.5 醋酸墨水染色(Quink牌墨水)

從圖5可知,醋酸墨水對AMF菌絲和泡囊的著色都很好,染色效果良好,在低倍鏡下就能清晰地觀察到AMF、DSE能在枸杞根系定殖,并發(fā)育形成泡囊和微菌核等典型結(jié)構(gòu).同時,醋酸墨水染色方法操作簡便,成本低且無毒,染色效果非常好.但是不同的脫色處理之間也存在差異.用2種不同的脫色劑進行脫色效果比較,發(fā)現(xiàn)清水脫色后背景幾乎完全褪色,AMF結(jié)構(gòu)染色效果與背景反差大,AMF泡囊處可見較清晰的AMF菌絲，可見DSE菌絲(圖5a-e).而用乳酸甘油脫色后觀察到的菌絲等結(jié)構(gòu)雖然脫色效果也較好(圖5f-j),但是相對于清水脫色的背景仍顯不足,可見醋酸墨水染色,清水脫色的方法更適用于枸杞根系內(nèi)生真菌的染色觀察.此外,利用醋酸墨水染色法還觀察到DSE菌絲形成前期的絲核菌菌絲(圖5j),未見AMF根內(nèi)孢子.

a.AMF菌絲和泡囊；b.AMF菌絲圈；c-d.AMF泡囊；e.DSE菌絲；f.AMF菌絲和DSE菌絲;g.AMF泡囊；h.DSE菌絲;i.DSE微菌核；j.DSE菌絲形成前期.圖5 枸杞根系內(nèi)生真菌醋酸墨水染色Fig.5 Endophytic fungi in Lycium barbarum roots dyed with vinegar and ink

2.6 不同染色方法對枸杞根系內(nèi)生真菌侵染定殖率的影響

使用5種染色方法對DSE、AMF定殖率進行統(tǒng)計,結(jié)果見表1.因不同染色方法對內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)的清晰度和反差效果存在較大差異,相同樣品得到的AMF和DSE定殖率明顯不同，其中用臺盼藍和醋酸墨水染色,AMF和DSE的定殖率沒有較大差異,其他染色方法獲得的定殖率普遍偏低.

表1 不同染色方法對枸杞AMF和DSE定殖率的影響Tab.1 Effects of different dyeing methods on colonization rate of AMF and DSE in Lycium barbarum

3 討論

內(nèi)生真菌定殖結(jié)構(gòu)觀察及侵染率測定主要采用染色鏡檢法,通常需要根系透明、染色和脫色3個步驟,其中最重要的是染色.目前對于根系內(nèi)生菌的染色可以采用臺盼藍、酸性品紅、墨水等多種染色劑[14].不同染色劑處理植物根系染色效果存在較大的差別,根系內(nèi)生真菌染色效果直接影響分析其侵染定殖的準確性,因此找到穩(wěn)定可靠、反差大、安全無毒的染色方法非常必要.

在光學顯微鏡下,觀察5種染色劑對枸杞根系內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)的染色效果.不同染色劑對內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)染色的清晰度、反差效果等方面存在較大差別.經(jīng)酸性品紅染色后,菌絲和泡囊著色較淺,DSE淺褐色菌絲可見,但根內(nèi)的皮層細胞也同樣著色,因此與背景的反差小.而高秀兵等[15]采用此染色法觀察茶樹根系,可清楚觀察到菌絲、泡囊、叢枝等AMF結(jié)構(gòu),推測可能是染色劑對不同植物著色效果不同.用苯胺藍染色時,AMF菌絲、泡囊著深藍色,可見DSE褐色菌絲,但部分雜質(zhì)被染上較深的顏色,較難準確辨別；經(jīng)蘇丹紅Ⅳ染色乳酸甘油脫色后背景褪色干凈,可觀察到AMF和DSE結(jié)構(gòu),但AMF菌絲顏色淺,這與覃曉娟[16]等報道的結(jié)果一致.用臺盼藍和墨水2種染液染色后,不僅AMF菌絲和泡囊染色效果較好,而且可觀察到DSE典型結(jié)構(gòu).本研究采用2種墨水，醋酸鴕鳥牌墨水對AMF菌絲、泡囊著色很差，背景褪色不干凈，而醋酸Quink牌墨水對AMF菌絲、泡囊著深藍色，背景與目標反差大，適合AMF的染色觀察．此外,Vierheilig[17]指出,當采用醋酸墨水和臺盼藍對不同植物根系進行染色,侵染定殖率結(jié)果并沒有明顯差異,這與本研究結(jié)果一致.然而,臺盼藍被國際癌癥研究機構(gòu)列為可能的致癌物,Quink牌墨水使用食用色素亮黑和堅牢黃2種染料,安全無毒[18].因此,通過對比可知,采用醋酸Quink牌墨水染色、清水脫色的枸杞根系根內(nèi)AMF菌絲等結(jié)構(gòu)著色深,脫色后背景褪色干凈,AMF與背景反差大,DSE菌絲等結(jié)構(gòu)也能被呈現(xiàn),既可以兼顧染色效果又安全無毒,更適合枸杞根系內(nèi)生真菌的侵染定殖觀察.

4 結(jié)論

醋酸Quink牌墨水和臺盼藍的染色效果最佳,根系皮層細胞內(nèi)AMF的菌絲、泡囊和DSE菌絲、微菌核等結(jié)構(gòu)清晰可見,能準確分辨出AMF、DSE和其他真菌.但綜合考慮操作難易程度和安全性,醋酸Quink牌墨水因操作簡單、安全無毒、染色效果好,更適用于枸杞根系內(nèi)生真菌的染色和制片觀察.