Shewanella sp.RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程影響因素

高嘉欣，路達(dá)，張玉，周集體

(1.大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

燃料燃燒過程產(chǎn)生的氮氧化物(NOx)是大氣中主要污染物，能夠產(chǎn)生酸雨、破壞臭氧層并引發(fā)光化學(xué)煙霧和霧霾等[1].一般燃燒煙氣的氮氧化物中90%為NO，常規(guī)的煙氣脫硝技術(shù)主要有選擇性催化還原(SCR)和選擇性非催化還原(SNCR)技術(shù)，這2種技術(shù)效率高、技術(shù)成熟，但也存在投資及運行費用高、易中毒、氨逃逸導(dǎo)致二次污染等缺點[2].除上述方法外，研究者對吸收法、吸附法和生物法煙氣脫硝技術(shù)也進(jìn)行了大量研究，其中針對煙氣中NO難溶于水和生物法去除NO的特點，殷祥果等[3]開發(fā)了絡(luò)合吸收煙氣脫硝技術(shù).該技術(shù)通常采用Fe(Ⅱ)EDTA吸收煙氣中NO產(chǎn)生溶于水的Fe(Ⅱ)EDTA-NO，同時Fe(Ⅱ)EDTA可被煙氣中O2氧化為Fe(Ⅲ)EDTA.針對Fe(Ⅱ)EDTA-NO和Fe(Ⅲ)EDTA的還原問題，研究者[4-5]開發(fā)了絡(luò)合吸收-生物還原煙氣脫硝技術(shù)(chemical absorption-biological reduction，CABR)，該技術(shù)利用微生物將絡(luò)合吸收煙氣脫硝過程產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)EDTA-NO和Fe(Ⅲ)EDTA還原，NO轉(zhuǎn)化為N2排放并實現(xiàn)Fe(Ⅱ)EDTA的還原再生.另外的研究者[6-7]在溶液中加入鐵屑將絡(luò)合吸收煙氣脫硝產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)EDTA-NO和Fe(Ⅲ)EDTA還原，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA實現(xiàn)再生而NO轉(zhuǎn)化為可以回收的氨，而王小軍等[8]通過加入硫化物也將Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原為氨.

針對上述Fe(Ⅱ)EDTA溶液煙氣脫硝后Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原和Fe(Ⅱ)EDTA再生的生物途徑和化學(xué)途徑，本課題組提出通過微生物將Fe(Ⅱ)EDTA-NO和Fe(Ⅲ)EDTA還原，并將絡(luò)合態(tài)NO直接還原為氨，以實現(xiàn)煙氣中NO資源化的新思路.該思路在實現(xiàn)Fe(Ⅱ)EDTA再生的同時，不用外加鐵屑等還原劑而只通過微生物實現(xiàn)了NO產(chǎn)氨過程，可以降低煙氣中氮氧化物資源化的運行成本[9].該過程產(chǎn)生的氨可以用來進(jìn)行氨法脫硫，并得到副產(chǎn)物硫酸銨肥料[10].

對于Fe(Ⅱ)EDTA-NO和Fe(Ⅲ)EDTA的生物還原通常通過異養(yǎng)反硝化菌和鐵還原菌實現(xiàn)，NO轉(zhuǎn)化為N2排放.劉楠等[11]分離出了能夠?qū)e(Ⅱ)EDTA-NO還原為氮氣的脫氮菌Pseudomonassp.，張士漢等[12-13]分別利用Enterobactercloacae和Pseudomonassp.DN-2還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO為氮氣，Kumaraswamy等[14]研究發(fā)現(xiàn)BacillusazotoformansKT-1可以將Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原為氮氣.對于可以直接將Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原為氨的純菌株鮮有報道[9].本課題組[15]研究認(rèn)為Desulfovibriosp.CMX可以將大部分Fe(Ⅱ)EDTA-NO轉(zhuǎn)化成氨，Shewanellasp.RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨也存在可行性[16].

微生物異養(yǎng)硝酸鹽還原為氨(DNRA)過程在自然生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，相關(guān)研究報道較多[17-18].影響DNRA過程的因素主要有氧化還原電位、碳源種類、C/N質(zhì)量比值、pH、溫度等[19].本研究利用實驗室篩出的1株醌還原菌Shewanellasp.RQs-106作為研究對象，考查碳源種類、C/N質(zhì)量比值、Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度、初始pH和溫度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響，并通過對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行對比和分析，尋找菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨的適宜條件.

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗所用Shewanellasp.RQs-106是本實驗室從大連市春柳河污水處理廠的厭氧污泥中篩選而來，在Genbank上登錄，其序列號為MF168410[20]，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.19242.

1.2 培養(yǎng)基

除特殊標(biāo)明外，實驗所用藥品均為分析純，且并未進(jìn)一步純化處理.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NaHPO4·12H2O,10.92 g/L;KH2PO4，2.65 g/L;K2HPO4，0.5 g/L;CaCl2·2H2O，0.1 g/L;NaCl，0.5 g/L;MgCl2·6H2O，0.1 g/L;1.24 g/L乳酸鈉.基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值為7.2.培養(yǎng)基曝氮氣20 min后，在0.1 MPa，121 ℃下滅菌20 min，滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)需轉(zhuǎn)移到厭氧箱中，防止進(jìn)氧.

Fe(Ⅱ)EDTA-NO的配置方法：

用物質(zhì)的量比為1∶1.1的硫酸亞鐵(FeSO4)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)配制成一定濃度(10 mmol/L)的溶液，并用2 mmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0.將制備的溶液轉(zhuǎn)入吸收瓶中，通入NO氣體.當(dāng)吸收瓶進(jìn)出口氣體中NO濃度一致時，停止吸收，驅(qū)氧密封保存.上述整個過程都在無氧條件下進(jìn)行(配置和轉(zhuǎn)移時以N2為保護(hù)氣)，實驗用水為驅(qū)氧超純水(超純水在厭氧瓶內(nèi)曝氮氣30 min)，溶液需在實驗當(dāng)天配制.

1.3 實驗方法

1.4 電子供體對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

在1 mmol/L Fe(Ⅱ)EDTA-NO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，控制溶液溫度30 ℃，初始pH值為7.2，分別加入甲酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉和檸檬酸鈉1.59、0.96、1.24、1.14 g/L，控制溶液C/N質(zhì)量比值均為20，考察菌株還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程適宜的電子供體.

1.5 C/N質(zhì)量比值對菌株RQs-106 還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

以1 mmol/L Fe(Ⅱ)EDTA-NO為唯一氮源，控制溶液溫度30 ℃，初始pH值為7.2，向培養(yǎng)基中分別加入0.31、0.62、0.93、1.24、1.55 g/L的乳酸鈉，使得厭氧瓶溶液中C/N質(zhì)量比值分別為5、10、15、20、25，考察菌株在不同C/N質(zhì)量比值條件下還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨的情況.

1.6 Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1、2、3、4 mmol/L的Fe(Ⅱ)EDTA-NO，控制溶液溫度30 ℃，初始pH值為7.2，C/N質(zhì)量比值為20，對應(yīng)添加1.24、2.49、3.73、4.98 g/L的乳酸鈉，考察Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度對菌株還原絡(luò)合態(tài)NO產(chǎn)氨過程的影響.

1.7 初始pH值對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

以乳酸鈉為碳源，1 mmol/L Fe(Ⅱ)EDTA-NO為電子受體，控制溶液溫度30 ℃，C/N質(zhì)量比值為20，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)的pH值分別為5.0、6.0、7.2、8.0和9.0，考察溶液pH值對菌株還原絡(luò)合態(tài)NO產(chǎn)氨過程的影響.

1.8 溫度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

以乳酸鈉為碳源，1 mmol/L Fe(Ⅱ)EDTA-NO為電子受體，控制溶液初始pH值為7.2，C/N質(zhì)量比值為20，厭氧瓶分別放置在20、25、30、35 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速均為150 r/min(搖床型號均為ZWYR-2102C)，考察溫度對菌株還原絡(luò)合態(tài)NO產(chǎn)氨過程的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 電子供體對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

碳源為生物還原Fe(Ⅱ))EDTA-NO并產(chǎn)生氨的過程提供了能源和電子供體，碳源種類甚至是決定異化硝酸鹽還原產(chǎn)物的關(guān)鍵因素[23].因此，本實驗考察了不同碳源、不同電子供體對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO并產(chǎn)氨的影響.由圖1可見，當(dāng)碳源為乙酸鈉(CH3COONa)和檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)時，在0～60 h，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO的濃度幾乎沒有變化，溶液中也未檢測到氨氮的存在，因此可以認(rèn)為乙酸鈉和檸檬酸鈉不能作為菌株RQs-106有效電子供體還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO；當(dāng)電子供體為乳酸鈉(C3H5NaO3)和甲酸鈉(HCOONa)時，菌株RQs-106可以將1 mmol/L的Fe(Ⅱ)EDTA-NO完全還原并將NO轉(zhuǎn)化為氨氮，使用前者可在36 h內(nèi)將Fe(Ⅱ)EDTA-NO降解完全，氨氮的產(chǎn)率為99%，而后者所需時間為48 h，氨氮的產(chǎn)率為95%，菌株RQs-106以乳酸鈉為電子供體時，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO還原產(chǎn)氨反應(yīng)速率明顯快于以甲酸鈉為電子供體時的反應(yīng)速率.

a.Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原曲線；生成曲線.圖1 電子供體對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響Fig.1 Effect of electron donors on Fe(Ⅱ)EDTA-NO reduction and ammonia production

2.2 C/N質(zhì)量比值對菌株RQs-106 還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

電子供體與電子受體的比例不同會導(dǎo)致硝酸鹽異化還原的途徑不同.許多學(xué)者[27-28]研究發(fā)現(xiàn)，具有硝酸鹽異化還原為氨能力的微生物更適合在電子供體充足即C/N質(zhì)量比值高的環(huán)境中生存，而反硝化微生物更適合C/N質(zhì)量比值低的環(huán)境.所以本實驗探究了不同C/N質(zhì)量比值條件下，菌株RQs-106異化還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO為氨的情況.實驗以Fe(Ⅱ)EDTA-NO和乳酸鈉作為唯一的電子受體和電子供體，結(jié)果如圖2所示.實驗結(jié)果顯示，C/N質(zhì)量比值增大，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO還原速率和氨氮生成速率加快，當(dāng)C/N質(zhì)量比值超過20后，反應(yīng)速率變化趨緩，在C/N質(zhì)量比值為20時，反應(yīng)36 h，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO降解率接近100%，氨氮生成率為97%.在0～12 h內(nèi)，當(dāng)C/N質(zhì)量比值為5～20時，在反應(yīng)的前12 h，菌株降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO的速率較慢，有明顯的適應(yīng)期.12 h以后，菌株降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO速率和產(chǎn)生氨氮速率明顯加快，且C/N質(zhì)量比值越大，降解速率加快越明顯.C/N質(zhì)量比值為25時，0～12 h內(nèi)的菌株降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO滯后期不明顯.在實驗的C/N質(zhì)量比值范圍內(nèi)，反應(yīng)60 h后，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO降解速率和氨氮生成率差別不大.

a.Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原曲線；生成曲線.圖2 C/N質(zhì)量比值對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響Fig.2 Effect of C/N mass ratio on Fe(Ⅱ)EDTA-NO reduction and ammonia production

對于混菌體系，van den Berg等[29]研究發(fā)現(xiàn)，DNRA菌和反硝化菌可在廣泛的C/N質(zhì)量比值間共存，在硝酸鹽限制的條件下，DNRA過程為主要過程，在醋酸鹽限制下，反硝化為主要過程，即隨C/N質(zhì)量比值增大，優(yōu)勢菌從反硝化菌轉(zhuǎn)為DNRA菌.Tugtas和Pavlostathis[30]研究發(fā)現(xiàn)在糊精/蛋白胨和葡萄糖環(huán)境中反硝化和DNRA過程是COD/N值的函數(shù).對于純菌體系，Yoon等[31]實驗結(jié)果表明，菌株Shewanellaloihicastrain PV-4在C/N質(zhì)量比值為4.5以上的條件下培養(yǎng)時，硝酸鹽異化還原為氨占優(yōu)勢，在4.5以下時，反硝化占優(yōu)勢.在謝柄柯等[32]的研究中，當(dāng)碳源濃度為3 mL/L和5 mL/L時，菌株Desulfovibriosp.CMX還原硝酸鹽、亞硝酸鹽速率和氨氮生成速率后者明顯大于前者，但當(dāng)碳源濃度超過5 mL/L后，DNRA速率無明顯增加.然而，也有研究表明，當(dāng)碳源量遠(yuǎn)高于菌體需求時，反而不利于DNRA過程[33].在本研究中，菌株發(fā)生DNRA的速率隨著C/N質(zhì)量比值的增大而增大，C/N質(zhì)量比值為25時，菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨的速率最快，但和C/N質(zhì)量比值為20時速率相比變化不明顯，綜合考慮降解速率和運行成本，適宜的C/N質(zhì)量比值為20.

2.3 Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

圖3為Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度為1～4 mmol/L時，菌株降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO和產(chǎn)氨結(jié)果.從圖3中可以看出，當(dāng)Fe(Ⅱ)EDTA-NO的濃度為1 mmol/L時，菌株可在36 h內(nèi)將Fe(Ⅱ)EDTA-NO完全降解，氨氮產(chǎn)生也達(dá)到了最大轉(zhuǎn)化率96%.當(dāng)Fe(Ⅱ)EDTA-NO的濃度為2～4 mmol/L時，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO幾乎沒有降解，氨氮產(chǎn)生量也可以忽略.

a.Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原曲線；生成曲線.圖3 Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響Fig.3 Effect of Fe(Ⅱ)EDTA-NO concentration on Fe(Ⅱ)EDTA-NO reduction and ammonia production

2.4 初始pH值對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

環(huán)境pH值對微生物的生命活動會產(chǎn)生影響，并可能影響代謝過程中酶的活性.由圖4可以看出，初始pH值對Fe(Ⅱ)EDTA-NO降解和氨氮生成影響很大.當(dāng)初始pH值為5.0和6.0時，反應(yīng)60 h內(nèi)Fe(Ⅱ)EDTA-NO沒有降解，氨氮沒有生成，說明pH值過低會抑制菌株的活性.當(dāng)pH為7.2、8.0、9.0時，60 h內(nèi)Fe(Ⅱ)EDTA-NO降解率均可達(dá)到90%以上.當(dāng)pH為7.2和8.0時，菌株RQs-106可在36 h內(nèi)完全降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO，pH值為8.0時Fe(Ⅱ)EDTA-NO降解速率略快.pH為9.0時，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO完全降解時間延長到60 h.

研究者發(fā)現(xiàn)高pH=(8.0)有利于土壤中DNRA發(fā)生[35].Zhang等[36]研究顯示，在中性(pH=6.2)和堿性(pH=8.2)土壤中，DNRA速率分別為0.48和1.09 mg/(kg·d)，而在酸性(pH=4.7)時DNRA過程可以忽略[36].DNRA過程更容易發(fā)生在中性偏堿性的環(huán)境條件下，但堿性條件過強(qiáng)會對DNRA功能微生物有抑制作用[29,37].對于本實驗來說，在pH值為5.0和6.0的酸性條件下，菌株不會對Fe(Ⅱ)EDTA-NO進(jìn)行還原，而在中性偏堿性的條件下，菌株發(fā)生DNRA的速率隨著pH值的增大而增大，但pH值為9.0時，堿性過高也會產(chǎn)生抑制作用.所以本實驗條件下，適宜pH值為8.0.

a.Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原曲線；生成曲線.圖4 pH值對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響Fig.4 Effect of pH on Fe(Ⅱ)EDTA-NO reduction and ammonia production

2.5 溫度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響

圖5為不同溫度下菌株RQs-106降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO和產(chǎn)氨結(jié)果.從圖5可以看出，在20～35 ℃內(nèi)，60 h內(nèi)菌株RQs-106均能將1 mmol/L的Fe(Ⅱ)EDTA-NO完全降解.溫度為30 ℃時，菌株RQs-106可以在36 h內(nèi)將Fe(Ⅱ)EDTA-NO完全還原，溫度為25 ℃時，菌株可以在48 h內(nèi)將Fe(Ⅱ)EDTA-NO完全還原，溫度為20 ℃和35 ℃時，F(xiàn)e(Ⅱ)EDTA-NO完全還原時間為60 h，但溫度為35 ℃時Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原速率高于溫度為20 ℃時的速率.

a.Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原曲線；生成曲線.圖5 溫度對菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的影響Fig.5 Effect of temperature on Fe(Ⅱ)EDTA-NO reduction and ammonia production

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，DNRA過程多發(fā)生與熱帶、亞熱帶土壤中.研究發(fā)現(xiàn)河口濕地土壤DNRA速率為0.45～2.92 nmol/(g·h)，夏季顯著高于冬季[38].Rahman等[39]實驗表明人工濕地中DNRA的速率隨著溫度的升高而增加，且比反硝化的速率增加的更快.Wang等[40]研究表明，市政污水處理廠在夏季采集的樣本中，DNRA微生物的絕對和相對豐度最高，且發(fā)生DNRA的速率最高.Lai等[41]研究顯示，溫度從10 ℃升高到40 ℃，土壤中硝酸鹽通過DNRA過程產(chǎn)氨率從4%增加到30%[41].在純菌研究中，賈雪等用菌株RQs-106還原亞硝酸鹽，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度小于30 ℃時，亞硝酸鹽的降解速率和產(chǎn)氨速率隨溫度的升高而增大，溫度為35 ℃產(chǎn)氨速率反而降低，且低于25 ℃的實驗組[16].對于本實驗，菌株發(fā)生DNRA的速率隨著溫度的升高，有先增大后減小的趨勢，溫度為30 ℃時的還原產(chǎn)氨速率最快，36 h內(nèi)即可反應(yīng)完全，而溫度過高或過低DNRA反應(yīng)速率均有所降低.如果將絡(luò)合吸收-生物還原法進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用，需人工將煙氣溫度降到微生物適宜生長的溫度.從圖5實驗結(jié)果可以看出，菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程的最適溫度為30 ℃.

3 結(jié)論

1)菌株RQs-106不能以乙酸鈉和檸檬酸鈉為電子供體還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨，電子供體為甲酸鈉和乳酸鈉時，均可進(jìn)行上述過程，乳酸鈉為最適宜的電子供體.

2)當(dāng)C/N質(zhì)量比值為5～25時，菌株RQs-106幾乎可全部降解1 mmol/L的Fe(Ⅱ)EDTA-NO，氨氮生成率均為95%以上，最適宜C/N質(zhì)量比值為20.

3)高濃度Fe(Ⅱ)EDTA-NO會抑制菌株RQs-106還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO的活性，本實驗條件下宜控制Fe(Ⅱ)EDTA-NO濃度為1 mmol/L.

4)當(dāng)初始pH值為5.0～6.0時，菌株RQs-106不能還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO，當(dāng)初始pH值為7.2～9.0時可將Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原為氨氮，但堿性增強(qiáng)會抑制菌株RQs-106的活性，較適宜的pH值為8.0.

5)菌株RQs-106可在20～35 ℃內(nèi)進(jìn)行還原Fe(Ⅱ)EDTA-NO產(chǎn)氨過程，但溫度過高或過低均會使Fe(Ⅱ)EDTA-NO還原速率下降，最適溫度為30 ℃.