氟[18F]比他班自動(dòng)化合成及初步臨床應(yīng)用

付華平，張曉軍，常 燕，王 媛，張錦明

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)是進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。據(jù)預(yù)測(cè)，到本世紀(jì)中葉，世界AD患者將增加至1.315億[2]，而國(guó)際老年癡呆協(xié)會(huì)中國(guó)委員會(huì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)65歲以上老年人癡呆患病率為6.6%，且患病率每5年約增長(zhǎng)一倍以上，80歲以上超過(guò)22%，到2050年，老年人口將增加到4億，癡呆患者將接近2 000萬(wàn)，中國(guó)的癡呆人數(shù)將以336%的比例增長(zhǎng)[3]。β淀粉樣蛋白是AD特征性的病理改變之一，能夠在AD早期反應(yīng)疾病的發(fā)展。采用特異性結(jié)合Aβ的探針，PET顯像可見AD患者腦內(nèi)Aβ蛋白分布，借助計(jì)算機(jī)軟件和生理數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量分析，可以提高AD的早期診斷率。碳[11C]-PIB是一種較理想的Aβ顯像劑，由于其親脂性高，在腦內(nèi)清除快，特異性強(qiáng)[4]，被稱為評(píng)價(jià)AD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于11C的半衰期只有20 min，只適用于擁有醫(yī)用回旋加速器的單位在線合成使用，每次合成僅夠1～2例患者使用。目前，國(guó)內(nèi)僅有幾家醫(yī)院具備生產(chǎn)和使用11C-PIB的條件，限制了其臨床應(yīng)用。18F-florbetaben用于疑似AD患者腦β-淀粉樣蛋白的視覺(jué)檢測(cè)，其靈敏度大于90%、特異性大于80%[5]，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)于2013年批準(zhǔn)該顯像劑上市，美國(guó)FDA也于2014年批準(zhǔn)Piramal Imaging公司氟[18F]比他班(商品名Neuraceq)上市，但是，針對(duì)該顯像劑的進(jìn)口生產(chǎn)模塊功能單一、價(jià)格昂貴，目前國(guó)內(nèi)尚未有醫(yī)院采購(gòu)該模塊用于臨床藥物生產(chǎn)。本研究使用改良后的國(guó)產(chǎn)氟多功能合成模塊自動(dòng)化合成氟[18F]比他班(18F-florbetaben)，進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，并初步進(jìn)行18F-florbetaben的臨床PET應(yīng)用研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

氧[18O]水(H18O豐度大于97%)：江蘇華益科技有限公司；合成試劑盒1、合成試劑盒2、純化試劑盒(試劑盒清單見表1)：德國(guó)ABX公司。

表1 18F-florbetaben試劑盒清單Table 1 Reagents list of 18F-florbetaben

1.2 儀器

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊：派特(北京)科技有限公司； 515 HPLC PUMP：美國(guó)Agilent公司；uMI 510 PET/CT掃描儀：上海聯(lián)影公司；SLGV233RS無(wú)菌液體濾膜：美國(guó)Millpores公司；BQSV-A.B.P.T濾膜壓力完整性測(cè)試儀：中國(guó)臺(tái)灣BQSV公司；InSpector Radiation ALERT表面沾污儀：美國(guó)S.E.公司；CRC-15R，CRC-25R活度計(jì)：美國(guó)Capintec公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周齡，(20±5) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2015.0001。

1.4 認(rèn)知功能正常健康受試者及臨床患者

該研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(S2018-166-01)。認(rèn)知功能正常健康受試者均為通過(guò)臨床查體和認(rèn)知健康評(píng)估人員：女性兩例(63和64歲)；阿爾茲海默病患者選自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科門診患者，參照Petersen等診斷標(biāo)準(zhǔn)：男性一例(76歲)，女性一例(75歲)；認(rèn)知功能正常健康受試者或患者家屬均簽署知情同意書。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 18F-florbetaben自動(dòng)化制備

加速器經(jīng)18O(p,n)18F反應(yīng)得到18F-，由N2載帶至QMA捕獲，用0.6 mL洗脫液(含22 mg K2.2.2、7 mg K2CO3、0.3 mL乙腈、0.3 mL水)將QMA柱上18F-洗脫至反應(yīng)瓶中，通入N2氣流100 mL/min，115 ℃加熱干燥4.5 min，再降低溫度至85 ℃加熱2 min保證除水完全；加入前體(7.0 mg叔丁氧羰-甲磺酸酯-二苯乙烯溶于1.8 mL乙腈)，120 ℃反應(yīng)10 min；冷卻后加入1.7 mL 2 mol/L鹽酸，在110 ℃下水解5 min；加入5 mL中和溶液(含1.2 mL 2 mol/L NaOH、0.8 mL 1.0 mol/L甲酸銨、0.5 mL水、0.5 mL乙醇、2 mL乙腈)；混勻后利用HPLC分離，流動(dòng)相為500 mL 60%乙醇水溶液(含0.16 g抗壞血酸、1.02 g抗壞血酸鈉)，流速6 mL/min)，收集tR=7 min處產(chǎn)品峰，通過(guò)無(wú)菌濾膜至產(chǎn)品瓶(收集60 s，共計(jì)6 mL)，再將23 mL稀釋基底液(含聚乙二醇400 5.2 mL、抗壞血酸0.15 g、抗壞血酸鈉0.98 g、無(wú)水乙醇0.75 mL)通過(guò)無(wú)菌濾膜洗入產(chǎn)品瓶，共29 mL。合成路線示于圖1。

圖1 18F-florbetaben合成路線示意圖Fig.1 Synthesis of 18F-florbetaben

2.2 18F-florbetaben的質(zhì)量控制

目檢18F-florbetaben注射液的性狀：顏色及澄清度；使用精密pH試紙測(cè)量酸堿度；使用活度計(jì)檢測(cè)產(chǎn)品的放射性活度；用半對(duì)數(shù)作圖法估計(jì)半衰期；使用碘鉑酸硅膠G薄層板檢測(cè)產(chǎn)品中K2.2.2含量；使用分析型HPLC測(cè)量化學(xué)純度和放化純度[色譜柱為Atlantis T3，150 mm×4.6 mm，5 μm: Waters，紫外波長(zhǎng)為320 nm，流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖溶液(含磷酸二氫鉀680.5 mg、水1 050 mL和85%的磷酸溶液0.85 mL)，B為乙腈；流速為1.5 mL/min，線性梯度洗脫：0～5.5 min B/A為40/60(v/v)；5.5～5.6 min B/A為90/10(v/v)；5.6～10 min B/A為60/40(v/v)；氣相色譜分析有機(jī)溶劑乙腈殘留；凝膠法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素；起泡點(diǎn)測(cè)試儀檢測(cè)無(wú)菌濾膜的完整性。

2.3 小鼠毒性實(shí)驗(yàn)

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.1 mL 20 mCi/mL的18F-florbetaben注射液，正常飼養(yǎng)，48 h觀察是否正常。

2.4 臨床PET/CT顯像

受試者按體質(zhì)量靜脈注射4.44 MBq/kg11C-PIB注射液并進(jìn)行PET/CT顯像；3 d后接受18F-florbetaben注射液，安靜環(huán)境下休息90 min后行頭部CT掃描，然后行PET圖像采集，動(dòng)態(tài)掃描20 min。CT重建采用標(biāo)準(zhǔn)重建法，利用CT數(shù)據(jù)對(duì)PET圖像進(jìn)行衰減校正；CT重建采用標(biāo)準(zhǔn)重建法，掃描參數(shù)：電壓120 kV，電流100 mA，層厚5 mm；PET圖像重建采用OSEM法，采用3D模式連續(xù)動(dòng)態(tài)采集20 min，矩陣336×336，軸向視野為21.6 cm，以ROI技術(shù)勾畫病變區(qū)域并計(jì)算SUVR。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-florbetaben注射液的自動(dòng)化制備

國(guó)產(chǎn)氟多功能模塊置于符合GMP環(huán)境要求的熱室內(nèi)，18F-florbetaben注射液利用該模塊自動(dòng)化合成。整個(gè)合成包括除水、氟化親核取代、脫保護(hù)基和半制備HPLC純化，合成耗時(shí)約為38 min，不校正合成效率為(45.0±2.3)%(n=6)，合成穩(wěn)定性和可靠性高。目前已合成30次，成功率100%，隨機(jī)三批藥物合成參數(shù)列于表2，分析型HPLC結(jié)果示于圖2。

表2 三批次藥物合成參數(shù)Table 2 Synthesis parameters of three batches of the drug

有不同工藝可用于合成18F-florbetaben：前體可為無(wú)保護(hù)基團(tuán)的Stilbene-PEG-OMs或含保護(hù)基團(tuán)的Boc-Stilbene-PEG-Oms，純化方法可以采用半制備HPLC或Sep-pek C18小柱，有文獻(xiàn)比較了不同前體和不同純化方法生產(chǎn)18F-florbetaben的異同，結(jié)果顯示以無(wú)保護(hù)基化合物為前體、使用C18柱純化在時(shí)間和產(chǎn)率上均占優(yōu)勢(shì)，但C18小柱純化無(wú)法實(shí)現(xiàn)前體的分離，產(chǎn)品中K2.2.2去除也不完全(雖然能通過(guò)半定量檢測(cè))[6]。本研究采用含有保護(hù)基團(tuán)的前體Boc-Stilbene-PEG-Oms，半制備HPLC純化，制備工藝嚴(yán)格按照美國(guó)FDA批準(zhǔn)的18F-florbetaben制備工藝進(jìn)行，該工藝使用一步除水，流動(dòng)相流速為6 mL/min，在合成時(shí)間和效率方面都有明顯優(yōu)勢(shì)。

3.2 18F-florbetaben注射液的質(zhì)量控制

在鉛玻璃下，產(chǎn)品為無(wú)色或淡黃色透明溶液，半衰期在105～115 min之間，γ能譜鑒定核素為18F，pH約為5.5；樣品放射性峰與標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收峰相對(duì)保留時(shí)間一致，18F-florbetaben放化純度大于95%，18F-florbetaben順式異構(gòu)體含量小于6%，其他化學(xué)雜質(zhì)總含量小于10%；K2.2.2含量低于50 μg/mL；乙腈殘留低于0.41 mg/mL，乙醇含量為12.4%；濾膜氣泡點(diǎn)大于1.5 bar；細(xì)菌內(nèi)毒素低于15 Eu/mL。使用當(dāng)前18F-florbetaben合成工藝，有三個(gè)產(chǎn)品質(zhì)控關(guān)鍵點(diǎn)：① 高活度下產(chǎn)品輻射分解；② 順式異構(gòu)體的放射化學(xué)含量；③ 含抗壞血酸(Vc)條件下K2.2.2測(cè)量。為了防止產(chǎn)品在高活度下輻射分解，除HPLC分離流動(dòng)相內(nèi)加入穩(wěn)定劑抗壞血酸/抗壞血酸鈉外，產(chǎn)品稀釋基底液中也加入了抗壞血酸/抗壞血酸鈉；18F-florbetaben在光照下會(huì)產(chǎn)生順式異構(gòu)體，為了減少其異構(gòu)體的出現(xiàn)，自動(dòng)化合成模塊增加了光源控制按鈕，在18F-傳輸完畢，關(guān)閉模塊光源，同時(shí)將熱室的光源關(guān)閉，產(chǎn)品合成過(guò)程為全自動(dòng)，此時(shí)控制計(jì)算機(jī)軟件即可完成產(chǎn)品合成與收集，最大程度減少了18F-florbetaben順式異構(gòu)體的出現(xiàn)；為了防止抗壞血酸對(duì)K2.2.2測(cè)量的干擾，對(duì)照品溶液均使用基質(zhì)溶液(含107.2 mg抗壞血酸、701.6 mg抗壞血酸鈉、16 mL水、4.4 mL聚乙二醇400和3.6 mL無(wú)水乙醇)配制。

a——18F-florbetaben的保留時(shí)間為4.228 min； b——標(biāo)準(zhǔn)品19F-florbetaben的保留時(shí)間為3.969 min 圖2 分析型HPLC譜圖Fig.2 HPLC spectrum of 18F-florbetaben

3.3 毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應(yīng)。

3.4 臨床初步應(yīng)用

臨床PET/CT圖像(圖3)顯示，認(rèn)知功能正常志愿者18F-florbetaben和11C-PIB顯像大腦形態(tài)如常，皮層各葉放射性分布未見明確濃聚，皮層下各神經(jīng)核團(tuán)顯影清晰，放射性分布對(duì)稱；而AD患者全腦18F-florbetaben SUVR為1.70，放射性分布增高、滯留，與11C-PIB基本一致。Senda等臨床藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，18F-florbetaben腦攝取迅速，從血中清除快，注射4 h后，血液中幾乎檢測(cè)不到放射性[7]。放射自顯影法并經(jīng)免疫組化染色等技術(shù)證實(shí)18F-florbetaben與AD患者大腦的β淀粉樣蛋白斑塊沉淀具有很高的結(jié)合力[8]，而且18F-florbetaben不與腦組織的tau蛋白或α-突觸核蛋白結(jié)合，顯示了它在診斷AD方面具有高的特異性[9]。有研究結(jié)果顯示18F-florbetaben與AD顯像劑“金標(biāo)準(zhǔn)”的11C-PIB的全腦SUVRs呈高度一致[10-11]。

圖3 NC組和AD組PET/CT圖像Fig.3 PET/CT images for NC and AD groups

4 小結(jié)

18F-florbetaben可以作為阿爾茨海默病診斷的一種理想顯像劑。針對(duì)該藥物進(jìn)口合成模塊的諸多局限，本研究提出使用改良的國(guó)產(chǎn)模塊自動(dòng)化合成18F-florbetaben，具有合成時(shí)間短、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)，可滿足藥物遠(yuǎn)距離配送的應(yīng)用需求，使無(wú)法生產(chǎn)該顯像劑的影像中心可以開展AD檢查，使患者受益。