穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的去甲烏藥堿的合成與表征

韓世磊，徐 銀，陳菊玲，楊立鳳，張 磊

1.天津阿爾塔科技有限公司，天津 300457； 2.阿爾塔(天津)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究院有限公司，天津 300457)

去甲烏藥堿最初是由Kosuge等從日本附子中分離提取，在臨床上用作強(qiáng)心劑、利尿劑、鎮(zhèn)痛劑和降壓劑等，服用或者誤服將會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)員的成績(jī)?cè)斐奢^大影響[1-2]。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(world anti-Doping agency, WADA)在《2019年禁用清單國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)》中已將其明確列為β2激動(dòng)劑類禁用物質(zhì)。2019年8月中國(guó)體育總局反興奮劑中心關(guān)于印發(fā)《大型賽事食源性興奮劑》防控工作指南(暫行)的通知中，明確規(guī)定要檢測(cè)沙丁胺醇、萊克多巴胺、沙美特羅、克倫丙羅、去甲烏藥堿和曲托奎酚等β2激動(dòng)劑。因此，有效的檢測(cè)手段運(yùn)用于各種食材的檢測(cè)以及人體代謝物的檢測(cè)尤為重要。日前，關(guān)于去甲烏藥堿的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)(HPLC-UV)法、液相色譜-熒光檢測(cè)(HPLC-FLD)法、高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)(HPLC-CECD)法和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法等[3-6]，但是其靈敏度有一定的局限性，當(dāng)濃度低于最低定量限時(shí)就無法滿足要求。同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物作為內(nèi)標(biāo)試劑，結(jié)合了色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性能力，通過檢測(cè)相應(yīng)質(zhì)量數(shù)的離子比值與標(biāo)準(zhǔn)比值可準(zhǔn)確定量，同時(shí)消除樣品前處理過程中引起的基質(zhì)效應(yīng)和回收率差異，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度[8]。因此，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑是該檢測(cè)方法能否使用的關(guān)鍵因素。

當(dāng)前，去甲烏藥堿已經(jīng)可以化學(xué)全合成，技術(shù)日趨成熟，諸多文獻(xiàn)已對(duì)其原藥的合成進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[9-11]，但關(guān)于去甲烏藥堿的同位素標(biāo)記化合物的文獻(xiàn)報(bào)道較少。有文獻(xiàn)報(bào)道了氚(T)標(biāo)記去甲烏藥堿化合物和去甲烏藥堿-13C標(biāo)記化合物的生物合成方法，但是放射性及實(shí)用性問題使其應(yīng)用受到限制[12-13]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道了一種關(guān)于中間體2-(3,4-二甲氧基苯)乙胺-D4的合成方法[15]，其以2-(3,4-二甲氧基苯)乙腈為原料，以雷尼鎳為催化劑，以D2為氘源，借助流體化學(xué)技術(shù)，合成目標(biāo)產(chǎn)物，收率達(dá)70%，但是與氨基相鄰碳上的氘代交換率僅17%，無法滿足要求。同時(shí)，該方法需要使用特殊的設(shè)備以及有安全風(fēng)險(xiǎn)的氘氣，因此并不適合普通實(shí)驗(yàn)室制備。為解決內(nèi)標(biāo)試劑的來源問題，本研究擬開發(fā)一條收率高、操作簡(jiǎn)便、同位素豐度高的合成路線，以期為更準(zhǔn)確地定量檢測(cè)去甲烏藥堿的痕量殘留提供標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)試劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

IKA-RCT basic型加熱型磁力攪拌器：德國(guó)IKA集團(tuán)；IKA HB10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA集團(tuán)；Bruker 600 MHz型核磁共振色譜儀：德國(guó)布魯克公司；Agilent1260+6120型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配自動(dòng)進(jìn)樣器與DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司；CHEETAH MP200型快速柱純化儀：天津博納艾杰爾科技有限公司；LC-IT-TOF-MS型高分辨質(zhì)譜儀：日本島津公司。

1.2 主要材料與試劑

2-(3,4-二甲氧基苯)乙腈：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；重水(99.8%D)、氘代硼氫化鈉(98%D)、氘代氫化鋁鋰(98%D)：美國(guó)劍橋穩(wěn)定同位素公司；4-甲氧基苯乙醛：上海畢德醫(yī)藥；其他試劑與藥品均為市售分析純，除特別說明外，未經(jīng)處理直接使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的去甲烏藥堿(6)的合成，以2-(3,4-二甲氧基苯)乙腈為起始原料，經(jīng)過堿催化的氫-氘同位素交換、氘還原、皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)環(huán)化反應(yīng)、脫甲基等關(guān)鍵反應(yīng)步驟，得到四氘代的去甲烏藥堿。合成路線示于圖1。

圖1 去甲烏藥堿-D4的合成路線Fig.1 Scheme for the synthesis of higenamine-D4

1.3.12-(3,4-二甲氧基苯)乙腈-D2(2)的合成 于氮?dú)獗Ｗo(hù)下將3,4-二甲氧基苯乙腈(1)(10.0 g)溶于60 mL的干燥THF和100 mL的D2O中，加入預(yù)先干燥的K2CO3(31.0 g, 4 eq，eq表示物料當(dāng)量)，反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?8 h。加入干燥的叔丁基甲基醚萃取，分液，有機(jī)相干燥、過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空干燥得到2-(3,4-二甲氧基苯)乙腈-D2(2)(9.5 g)，收率95.0%。1H NMR(600 MHz,Chloroform-d)δ6.87-6.82(m,2H),6.80(d,J=1.9 Hz,1H),3.88(d,J=8.5 Hz,6H)。

1.3.22-(3,4-二甲氧基)苯乙胺鹽酸鹽-D4(3)的合成 于氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物(2)(3.0 g)溶于干燥的THF和MeOD的混合溶劑(5∶1，60 mL)中，依次加入(Boc)2O(8.0 g,2.0 eq)、氯化鎳(0.23 g,1.1 eq)，冰浴冷卻至10 ℃左右。攪拌下分批加入氘代硼氫化鈉(1.29 g，2.0 eq)，然后自然升至室溫，攪拌過夜。反應(yīng)完畢后，加入飽和氯化銨水溶液淬滅，乙酸乙酯萃取，干燥、過濾，減壓濃縮，粗品經(jīng)Flash柱色譜純化得到Boc保護(hù)的中間體，然后再加入1 mol/L的鹽酸/乙酸乙酯溶液(50 mL)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空干燥得到2-(3,4-二甲氧基苯)乙胺鹽酸鹽-D4(3)3.8 g，收率80.0%。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ8.03(br,3H),6.93-6.83(m,2H),6.75(dd,J=8.1,2.0 Hz,1H),3.74(d,J=19.2 Hz,6H)。

1.3.36,7-二甲氧基-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-3,3,4,4-D4(5)的合成 于氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物(3)(500 mg,1 eq)和對(duì)甲氧基苯乙醛(4)(500 mg,1.5 eq)溶于無水甲苯(20 mL)中，加入對(duì)甲苯磺酸(600 mg，1.5 eq)，反應(yīng)混合物加熱回流3 h。反應(yīng)液冷卻后，用水洗滌，干燥、過濾、濃縮。粗產(chǎn)品經(jīng)Flash柱色譜純化得到中間體(5)400 mg，收率55.0%。1H NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ8.50(s,1H),7.26-7.19(m,2H),6.97(d,J=8.7 Hz,1H),6.82(s,1H),6.49(s,1H),4.67(t,J=7.4 Hz,1H),3.83(d,J=11.7 Hz,6H),3.66(s,3H),3.37(dd,J=14.1,7.1 Hz,1H),3.14(dd,J=14.1,7.7 Hz,1H)。

1.3.4穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的去甲烏藥堿(6)的合成 于氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物(5)(200 mg)溶于無水二氯甲烷中，冷卻至0 ℃。攪拌下緩慢滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1 mol/L,3.8 mL，6 eq)，加畢，升至室溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)完畢后，用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至12，分出水層，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7，析出的固體經(jīng)過濾、干燥，粗產(chǎn)物經(jīng)反相色譜純化后得到去甲烏藥堿-D4，89.2 mg，白色固體，收率51.4%，HPLC純度98.0%，氘豐度為96.5%。HRMSm/z:[M+H]+=276.152 8(理論值276.153)。1H NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ7.14(d,J=8.5 Hz,1H),6.81(d,J=8.5 Hz,1H),6.63(s,1H),6.62(s,1H),4.58(dd,J= 8.9,5.6 Hz,1H),3.37(dd,J=14.6,5.6 Hz,1H),2.97(dd,J=14.6,9.0 Hz,1H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 去甲烏藥堿-D4(6)的合成

2.1.12-(3,4-二甲氧基苯)乙腈-D2(2)的合成 在化合物(2)的合成研究中，對(duì)不同的氘源及堿作為氫-氘交換的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果列于表1。從表1中可以看到，無論是有機(jī)金屬堿還是無機(jī)堿，底物交換反應(yīng)后的同位素豐度均較高，但是有機(jī)金屬試劑作為堿時(shí)，反應(yīng)體系有較多的雜質(zhì)，收率相對(duì)較低，而用氫氧化鈉或者氘氧化鈉作堿時(shí)，產(chǎn)物收率明顯降低，推測(cè)可能是由于底物分子中的氰基水解所致，綜合實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性及原輔材料廉價(jià)易得性，最終選擇K2CO3/THF/D2O體系進(jìn)行該步氘-氫交換反應(yīng)。

此外，針對(duì)表1中反應(yīng)條件3的堿和重水的使用量、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)收率和同位素豐度的影響進(jìn)行研究，結(jié)果列于表2。由表2結(jié)果可知，反應(yīng)溫度對(duì)同位素豐度影響較小，但是在較高溫度下反應(yīng)收率有降低的趨勢(shì)，而增加重水的使用量和反應(yīng)時(shí)間有利于提高產(chǎn)物的同位素豐度。

表1 化合物(2)合成的反應(yīng)條件篩選Table 1 Reaction condition screening for the synthesis of compound (2)

表2 試劑與底物的物質(zhì)的量比對(duì)化合物(2)合成的影響Table 2 Effect of materials ratio on for the synthesis of compound (2)

2.1.22-(3,4-二甲氧基)苯乙胺鹽酸鹽-D4(3)的合成 在化合物(3)的合成研究中，針對(duì)不同還原劑、溶劑對(duì)反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果列于表3。使用四氫鋁鋰作還原劑時(shí)，由于淬滅過程中產(chǎn)生的鋁鹽對(duì)產(chǎn)物的包裹，導(dǎo)致收率較低；而硼氫化鈉作為還原劑并進(jìn)行“一鍋法”投料，使還原生成的胺原位生成Boc保護(hù)的胺，然后脫去Boc保護(hù)基得到目標(biāo)化合物(3)，可極大地提高產(chǎn)物收率。此外，使用四氫呋喃-甲醇做共溶劑可極大地提高反應(yīng)速率，而用氘代甲醇(CH3OD)替換甲醇(CH3OH)，可有效避免氫-氘交換，將產(chǎn)物的同位素豐度提高約97%。

表3 不同還原劑對(duì)化合物(3)合成的影響Table 3 Effect of reducing agents on the synthesis of compound (3)

2.1.36,7-二甲氧基-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-3,3,4,4-D4(5)的合成 化合物(5)的合成屬于Pictet-Spengler環(huán)化反應(yīng)，本文對(duì)不同的酸性試劑及溶劑對(duì)反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果列于表4。對(duì)甲苯磺酸作為質(zhì)子酸體系催化效果較好，而其他酸性試劑如鹽酸體系結(jié)果不理想。

表4 催化劑對(duì)化合物(5)合成的影響Table 4 Effect of catalyst on the synthesis of compound (5)

2.1.4去甲烏藥堿-D4(6)的合成 使用氫溴酸作為脫甲基化試劑，產(chǎn)物色素較重，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)控不利，而使用三溴化硼作為脫甲基化試劑有效避免了該問題。此外，在后處理過程中發(fā)現(xiàn)，因該化合物分子同時(shí)含有酸性基團(tuán)(酚羥基)和堿性基團(tuán)(氨基)，體系的pH對(duì)結(jié)晶析出及收率至關(guān)重要，而且化合物含極性基團(tuán)較多，其在水中具有一定的溶解性，水的使用量對(duì)其收率也有較大影響。

2.2 去甲烏藥堿-D4(6)的鑒定與表征

2.2.11H NMR 本文中所有化合物均通過1H NMR和HRMS進(jìn)行鑒定，檢測(cè)結(jié)果與結(jié)構(gòu)相符。去甲烏藥堿-D4(6)的1HNMR譜圖示于圖2。δ7.14 ppm,6.81 ppm兩個(gè)雙重峰為4-羥基苯甲基片段中苯環(huán)上的氫,6.63 ppm、6.62 ppm兩個(gè)單峰為1,2,3,4-四氫異喹啉結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上兩個(gè)氫,δ4.58 ppm峰為1,2,3,4-四氫異喹啉結(jié)構(gòu)中1-位手性次甲基氫與相鄰的亞甲基耦合的核磁信號(hào)。與該手性中心相連的4-羥基苯甲基片段中芐位亞甲基上的兩個(gè)質(zhì)子(圖3)為化學(xué)位移不等價(jià)，在δ3.37 ppm、2.97 ppm表現(xiàn)為兩個(gè)多重峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。去甲烏藥堿-D4(a)與非標(biāo)記的去甲烏藥堿(b)的氫核磁譜圖對(duì)比示于圖4，由于四氫異喹啉3-位和4-位亞甲基上的質(zhì)子被氘原子取代，因此在去甲烏藥堿-D4(6)的氫核磁譜圖上無信號(hào)峰。

圖2 去甲烏藥堿-D4的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of higenamine-D4

圖3 模擬的去甲烏藥堿的立體結(jié)構(gòu)Fig.3 Simulated 3D structure of higenamine

圖4 1H NMR核磁譜圖比對(duì)Fig.4 1H NMR comparison spectra of higenamine-D4 and higenamine

2.2.2HRMS確證及同位素豐度確認(rèn) 去甲烏藥堿-D4的精確相對(duì)分子質(zhì)量通過飛行時(shí)間質(zhì)譜得到確認(rèn)。通過質(zhì)譜的結(jié)果(圖5)可知，目標(biāo)化合物的分子離子峰[M+H]+=276.152 8，與理論計(jì)算結(jié)果[M+H]+=276.153 8相符。

圖5 去甲烏藥堿-D4的HRMS譜圖Fig.5 HRMS spectrum of higenamine-D4

同時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析，用“質(zhì)量簇分類法”[16-17]計(jì)算，去甲烏藥堿-D4氘同位素的豐度為96.5%，具體計(jì)算過程如下。

去甲烏藥堿-D4的質(zhì)譜峰簇為：m/z=272～278,非氘標(biāo)記的化合物天然豐度分布的占比(歸一化后)應(yīng)為A272∶A273∶A274=0.84∶0.15∶0.01。將所采集到的質(zhì)譜圖中m/z=272、273、274、275、276的峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)歸一化后分別記為A0、A1、A2、A3、A4,代入方程組(1)計(jì)算，解xj(j=0、1、2、3、4)。

A0=0.84x0=0

A1=0.15x0+0.84x1=0

A2=0.01x0+0.15x1+0.84x2=0

(1)

A3=0.01x1+0.15x2+0.84x3=11.4

A4=0.01x2+0.15x3+0.84x4=72.6

從上述方程組中求得x0=0，x1=0，x2=0，x3=13.57，x4=84.01。

去甲烏藥堿-D4的同位素豐度值以E表示，按公式(2)計(jì)算得到同位素豐度，即氘原子標(biāo)記率E=96.5%。

(2)

式中：xj表示標(biāo)記j個(gè)D原子的去甲烏藥堿-Dj分子的摩爾分?jǐn)?shù)，其中j=0、1、2、3、4。

3 結(jié)論

本文以2-(3,4-二甲氧基苯)乙腈為起始原料，以廉價(jià)易得的重水為穩(wěn)定同位素標(biāo)記源，經(jīng)過氫-氘交換，再經(jīng)氘代金屬還原劑還原得到關(guān)鍵中間體2-(3,4-二甲氧基苯)乙胺鹽酸鹽-D4，再經(jīng)關(guān)環(huán)、脫保護(hù)基等步驟，合成了去甲烏藥堿-D4。其中關(guān)鍵是氫-氘交換和氘代還原兩個(gè)過程對(duì)化合物同位素豐度的控制，經(jīng)過條件優(yōu)化，最終合成得到的關(guān)鍵中間體的同位素豐度達(dá)到了預(yù)期，且后續(xù)反應(yīng)并未有明顯的同位素豐度稀釋現(xiàn)象。本文所合成的目標(biāo)化合物能作為內(nèi)標(biāo)試劑滿足去甲烏藥堿的定性與定量分析。