大鼠腎虛型椎間盤軟骨終板退變病證結(jié)合模型的構(gòu)建與評價

夏炳江，沈興潮，胡松峰，韋金忠，許楊

(紹興市中醫(yī)院，浙江 紹興 312000)

軟骨終板(cartilage endplate，CEP)退變被認(rèn)為是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)的始動因素[1-2]，研究CEP退變可為早期防治IDD提供新的理論依據(jù)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎虛”為腰痛的關(guān)鍵病機(jī)[3]，補腎中藥治療與IDD相關(guān)的疾病具有獨特優(yōu)勢[4]，但要進(jìn)一步探討其作用機(jī)制或?qū)ζ溆行院桶踩赃M(jìn)行驗證，尚需進(jìn)行大量的動物實驗。病證結(jié)合動物模型以疾病模型為基礎(chǔ)，具有較好的可靠性和穩(wěn)定性，同時引入“證候”概念，能很好體現(xiàn)中醫(yī)“證候”的階段性及動態(tài)性變化，是研究中醫(yī)臨床疾病的良好平臺和載體[5]。目前，在CEP退變的研究領(lǐng)域尚缺乏適宜于中醫(yī)藥研究的病證結(jié)合動物模型。本文擬通過切除大鼠雙側(cè)卵巢并結(jié)合阻斷CEP營養(yǎng)供應(yīng)法而構(gòu)建腎虛型CEP退變病證結(jié)合動物模型，以進(jìn)一步研究病與證之間的內(nèi)在規(guī)律。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物12周齡SPF級雌性SD大鼠108只，體質(zhì)量(200±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(浙)2008-0115。所有大鼠普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自然光照，自由進(jìn)食進(jìn)水。實驗方案通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。

1.2 實驗儀器與試劑組織脫水機(jī)(日本櫻花公司)，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國Leica公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain recation，PCR)儀(美國ABI公司)，普通PCR儀(德國Eppendorf公司)，多光譜小動物活體成像儀(美國Carestream Health公司)，Micro-CT(瑞士Scanco Medical AG公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)，定量試劑盒(大連TaKaRa公司)，PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

2 方 法

2.1 動物分組與造模將108只大鼠，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計原則，隨機(jī)分為空白組、CEP退變模型組和病證結(jié)合模型組，每組36只。CEP退變模型組大鼠采用椎間盤CEP下骨質(zhì)無水酒精注射阻斷CEP營養(yǎng)供應(yīng)法構(gòu)建CEP退變模型，具體方法如下：以氯胺酮(0.1 g·kg-1)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，在X線透視儀的輔助下定位手術(shù)區(qū)域[圖1(1)]。取大鼠尾部背側(cè)正中縱形切口，長1～1.5 cm，切開皮膚、皮下組織，顯露椎體上、下方的CEP及椎間盤[圖1(2)]。分別于椎體兩端距離CEP 1～2 mm處，用直徑0.6 mm的硬質(zhì)針行局部椎體內(nèi)穿刺至骨髓腔[圖1(3)]，針尾連接注射器，通過加壓作用注入50 μL無水酒精。利用無水酒精的去血管化作用，使椎體內(nèi)骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速脫水、蛋白變性凝固，小血管閉塞，從而造成微循環(huán)的破壞，CEP營養(yǎng)供應(yīng)阻斷。病證結(jié)合模型組大鼠采用摘除大鼠雙側(cè)卵巢結(jié)合椎間盤CEP下骨質(zhì)無水酒精注射阻斷CEP營養(yǎng)供應(yīng)法構(gòu)建腎虛型CEP退變病證結(jié)合模型。CEP退變模型組與病證結(jié)合模型組大鼠術(shù)后均肌肉注射1萬單位青霉素預(yù)防感染，每天1次，持續(xù)3 d，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動?？瞻捉M大鼠不做任何處理。

圖1 椎間盤軟骨終板退變模型構(gòu)建過程

2.2 腎虛模型鑒定

2.2.1大鼠表觀特征觀察和腎虛癥狀體征量化評分測定 造模后觀察并記錄大鼠表觀特征，包括大鼠毛發(fā)光澤度、飲水、精神狀態(tài)、大便性狀、活動狀態(tài)等情況，結(jié)合文獻(xiàn)[6]擬定大鼠腎虛癥狀體征量化評分表(表1)進(jìn)行評分測定。

表1 大鼠腎虛癥狀體征量化評分表

2.2.2尾椎骨密度與骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)測算 分別于造模后4周、8周，從各組隨機(jī)抽取6只大鼠，以氯胺酮(0.1 g·kg-1)行腹腔注射麻醉后，采用多光譜小動物活體成像儀攝尾椎X線片，并利用成像儀自帶軟件測算尾椎骨密度。然后，采用二氧化碳窒息法處死大鼠，仔細(xì)分離軟組織，取出尾椎，修剪去除椎體附件后將其固定在Micro-CT載物臺上，采用Micro-CT掃描大鼠尾椎的骨微結(jié)構(gòu)，選取感興趣區(qū)域骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用N-Recon軟件、CT-AN軟件測算骨小梁數(shù)目(trabecular number，TN)、骨小梁分離度(trabecular separation，TS)、骨小梁厚度(trabecular thickness，TT)。

2.3 椎間盤CEP退變模型鑒定

2.3.1組織病理學(xué)觀察 分別于造模后4周、8周，從各組隨機(jī)抽取6只大鼠，切取造模椎間盤(連同其上、下部分椎體組織)，10%磷酸鹽緩沖液甲醛固定72 h，14%乙二胺四乙酸脫鈣2周，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚約5 μm，HE染色觀察各組大鼠椎間盤CEP組織退變情況。

2.3.2椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表達(dá)檢測 分別于造模后4周、8周，從各組隨機(jī)抽取6只大鼠，仔細(xì)分離造模椎間盤CEP組織，利用液氮迅速冷凍后將其研磨成粉。利用Trizol提取液提取總RNA，以實時定量PCR法檢測椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖和含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type Ⅰ motifs，ADAMTS)-5基因表達(dá)量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，引物序列見表2。目標(biāo)基因的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCT法與GAPDH的表達(dá)水平進(jìn)行校正。

表2 大鼠椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因引物

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析；3組大鼠尾椎骨密度、骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)以及聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表達(dá)量的組間總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況在造模過程中，所有大鼠均無意外死亡發(fā)生。CEP退變模型組1只大鼠術(shù)后3 d出現(xiàn)尾部切口愈合不良、壞死現(xiàn)象[圖2(1)]，換藥后1周左右切口愈合；其余大鼠尾部切口均愈合良好[圖2(2)]。

圖2 大鼠術(shù)后尾部皮膚切口外觀

3.2 腎虛模型鑒定結(jié)果

3.2.1大鼠表觀特征 造模后，空白組與CEP退變模型組大鼠毛發(fā)柔順有光澤，飲食適量，兩眼有神，大便軟硬適中，抓取時反抗有力，不易激惹；病證結(jié)合模型組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)枯槁易脫落、飲食增多、精神倦怠、兩眼無神、大便干結(jié)變硬、活動減少、反應(yīng)遲鈍等腎虛的表現(xiàn)。

3.2.2腎虛癥狀體征量化評分 時間因素和分組因素存在交互效應(yīng)。3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即存在分組效應(yīng)。造模后不同時間點大鼠腎虛癥狀體征量化評分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即存在時間效應(yīng)。造模后，3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分隨時間變化趨勢不一致，空白組大鼠腎虛癥狀體征量化評分隨時間未見明顯變化，

CEP退變模型組和病證結(jié)合模型組大鼠腎虛癥狀體征量化評分隨時間均呈升高趨勢。造模后2周，3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后4周、6周、8周，3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分比較，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和CEP退變模型組大鼠腎虛癥狀體征量化評分均低于病證結(jié)合模型組(造模后4周：LSD-t=4.082，P=0.002； LSD-t=4.491，P=0.001。造模后6周：LSD-t=6.725，P=0.000；LSD-t=7.206，P=0.000。造模后8周：LSD-t=8.485，P=0.000；LSD-t=8.132，P=0.000)；空白組與CEP退變模型組大鼠腎虛癥狀體征量化評分比較，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(造模后4周：LSD-t=0.408，P=0.690；造模后6周：LSD-t=0.480，P=0.640；造模后8周：LSD-t=0.354，P=0.730)。見表3。

表3 3組大鼠腎虛癥狀體征量化評分

3.2.3尾椎骨密度 造模后4周，3組大鼠尾椎骨密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和CEP退變模型組大鼠尾椎骨密度均高于病證結(jié)合模型組(LSD-t=3.682，P=0.003；LSD-t=3.028，P=0.011)；空白組大鼠尾椎骨密度與CEP退變模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.655，P=0.525)。造模后8周，3組大鼠尾椎骨密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和CEP退變模型組大鼠尾椎骨密度均高于病證結(jié)合模型組(LSD-t=3.749，P=0.003；LSD-t=3.035，P=0.010)；空白組大鼠尾椎骨密度與CEP退變模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.714，P=0.489)。見表4。

表4 3組大鼠尾椎骨密度

3.2.4骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo) 造模后4周，3組大鼠TN、TS比較，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和CEP退變模型組大鼠TN高于病證結(jié)合模型組(LSD-t=12.991，P=0.000；LSD-t=10.657，P=0.000)，TS低于病證結(jié)合模型組(LSD-t=4.623,P=0.001；LSD-t=2.736，P=0.018)；空白組大鼠TN和TS與CEP退變模型組比較，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(TN：LSD-t=0.432，P=0.924；TS：LSD-t=1.887，P=0.084)。造模后8周，3組大鼠TN、TS比較，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；病證結(jié)合模型組大鼠TN低于空白組和CEP退變模型組(LSD-t=6.854,P=0.000；LSD-t=5.750，P=0.000)，TS高于空白組和CEP退變模型組(LSD-t=3.623，P=0.003；LSD-t=3.106，P=0.009)；空白組大鼠TN和TS與CEP退變模型組比較，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(TN：LSD-t=1.104，P=0.291；TS：LSD-t=0.518，P=0.614)。造模后4周、8周，3組大鼠TT比較，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 3組大鼠尾椎骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)

3.3 椎間盤CEP退變模型鑒定結(jié)果

3.3.1椎間盤CEP組織形態(tài) 造模后4周、8周，空白組軟骨細(xì)胞分布均勻，潮線清晰，染色均勻；CEP退變模型組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，有少量簇聚軟骨細(xì)胞，潮線不清；病證結(jié)合模型組軟骨細(xì)胞排列紊亂、簇聚，軟骨鈣化層增厚，潮線模糊，染色不均勻；CEP退變模型組和病證結(jié)合模型組大鼠尾椎CEP均逐漸出現(xiàn)退變，病證結(jié)合模型組退變更明顯(圖3、圖4)。

圖4 造模后8周3組大鼠軟骨終板組織形態(tài)(HE染色 ×50)表6 3組大鼠椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表達(dá)量

圖3 造模后4周3組大鼠軟骨終板組織形態(tài)(HE染色 ×50)

3.3.2椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因的表達(dá) 造模后4周、8周，3組大鼠椎間盤CEP組織聚集蛋白聚糖基因表達(dá)量比較，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組大鼠聚集蛋白聚糖基因表達(dá)量高于CEP退變模型組和病證結(jié)合模型組(造模后4周：LSD-t=4.045，P=0.002；LSD-t=6.815，P=0.000。造模后8周：LSD-t=4.329，P=0.001； LSD-t=6.774，P=0.000)，CEP退變模型組大鼠聚集蛋白聚糖基因表達(dá)量高于病證結(jié)合模型組(造模后4周：LSD-t=2.770，P=0.017。造模后8周：LSD-t=2.445，P=0.031)。造模后4周、8周，3組大鼠椎間盤CEP組織ADAMTS-5基因表達(dá)量比較，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組大鼠ADAMTS-5基因表達(dá)量低于CEP退變模型組與病證結(jié)合模型組大鼠(造模后4周：LSD-t=3.543，P=0.004；LSD-t=11.104，P=0.000。造模后8周：LSD-t=6.702，P=0.000；LSD-t=14.821，P=0.000)，CEP退變模型組大鼠ADAMTS-5基因表達(dá)量低于病證結(jié)合模型組(造模后4周：LSD-t=7.562，P=0.000；造模后8周：LSD-t=8.119，P=0.000)。見表6。

4 討 論

目前，中醫(yī)藥動物模型在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用[7]，且在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下構(gòu)建的病證結(jié)合模型已成為當(dāng)前研究中醫(yī)藥動物模型的發(fā)展趨勢[8-9]。本研究通過去除大鼠卵巢的方法構(gòu)建腎虛型疾病動物模型，在此基礎(chǔ)上通過阻斷CEP的營養(yǎng)供應(yīng)途徑模擬人類椎間盤CEP退變模型，試圖構(gòu)建腎虛型CEP退變病證結(jié)合模型。該模型的構(gòu)建可進(jìn)一步為研究椎間盤CEP退變發(fā)生的病理變化過程、中醫(yī)藥干預(yù)治療以及預(yù)防提供一個科學(xué)的實驗載體。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，藏精氣，主骨、生髓、化血，主人體生長發(fā)育、生殖和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，為正氣之根[10]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、生殖、造血等多個系統(tǒng)有密切的關(guān)系[11-13]。已有研究表明，腎虛可導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸各環(huán)節(jié)功能存在不同程度的紊亂[14-15]。有學(xué)者已成功建立了腎虛型疾病動物模型，并把動物的行為學(xué)改變作為判別腎虛證模型構(gòu)建成功的指標(biāo)之一[16-17]?！端貑枴ば魑鍤狻吩唬骸澳I主骨生髓”“其充在腎”，即腎精充足，骨髓生化有源，則骨骼得到骨髓的充養(yǎng)而堅固有力[18]。若腎精虛少，骨髄化源不足，則不能滋養(yǎng)骨骼，易出現(xiàn)骨骼脆弱，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生[19-20]。因此，本研究把骨骼的榮枯，即骨質(zhì)疏松作為判定腎虛證的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，造模后病證結(jié)合模型組大鼠逐漸表現(xiàn)出毛發(fā)枯槁易脫落、精神倦怠、兩眼無神等與人類類似的腎虛證表現(xiàn)，且骨密度顯著降低，骨微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了相應(yīng)變化。這提示腎虛造模(去卵巢)大鼠出現(xiàn)了腎精虧虛，致使骨髓生化無源，骨骼不能得到充養(yǎng)，進(jìn)而出現(xiàn)骨枯(骨質(zhì)疏松)，說明腎虛型模型構(gòu)建成功。

在本研究中，應(yīng)用無水酒精注射阻斷大鼠CEP營養(yǎng)供應(yīng)后，組織病理學(xué)提示CEP組織逐漸出現(xiàn)退變表現(xiàn)，表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，軟骨細(xì)胞簇聚，潮線模糊，染色不均，CEP鈣化和骨化，軟骨下骨骨板增厚等，提示CEP退變模型構(gòu)建成功，這與袁維等[21]的研究結(jié)果類似。此外，我們研究也發(fā)現(xiàn)，病證結(jié)合模型組較CEP退變模型組，椎間盤CEP組織退變程度更重，提示腎虛可以加速CEP退變，進(jìn)一步印證了“腎主骨生髓”的理論。此外，有學(xué)者研究認(rèn)為，骨密度與IDD程度呈負(fù)相關(guān)，即骨密度越低，IDD程度越重[22]；其可能的發(fā)生機(jī)制為：骨密度降低，骨骼強度下降，引起骨性終板或椎體發(fā)生微小骨折，導(dǎo)致椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)破壞，從而影響椎間盤的代謝和血液循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致IDD[23]。

在造成軟骨退變與破壞的眾多影響因素中，基質(zhì)降解酶活性增高是最主要和最直接的原因之一。聚集蛋白聚糖的降解被認(rèn)為是軟骨退變的重要指標(biāo)[24-26]。ADAMTS-5是目前公認(rèn)的最重要的聚蛋白聚糖酶之一，在降解軟骨聚集蛋白聚糖的過程中起重要作用[27]。本研究采用無水酒精注射阻斷CEP營養(yǎng)供應(yīng)后，大鼠CEP組織中聚集蛋白聚糖基因表達(dá)量明顯下降，而ADAMTS-5基因表達(dá)量明顯上升，提示CEP細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)了降解，從而導(dǎo)致CEP組織發(fā)生退變。此外，本研究結(jié)果顯示，造模后病證結(jié)合模型組CEP組織中聚集蛋白聚糖基因表達(dá)量低于CEP退變模型組，而ADAMTS-5基因表達(dá)量高于CEP退變模型組，說明聯(lián)合應(yīng)用去卵巢法(腎虛)可進(jìn)一步促進(jìn)CEP退變。

本研究結(jié)果顯示，切除雙側(cè)卵巢結(jié)合阻斷CEP營養(yǎng)供應(yīng)法是構(gòu)建大鼠腎虛型椎間盤CEP退變病證結(jié)合模型的一種可行方法。