HPLC法同時測定清火抗毒丸中三種成分的含量

郭慧青 趙 穎 高振東 張旭東 顧艷麗* 徐佳璐 謝宇鑫

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市殘聯(lián)眼科醫(yī)院，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000

清火抗毒丸是巴彥淖爾市眼科醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)師常用且效果良好的內(nèi)服組方，由梔子、龍膽、黃芩、黃連和黃柏等十三味藥組成，具有抗菌、抗炎、解毒、清熱等功效，適用于角膜炎、細(xì)菌性或病毒性結(jié)膜炎、瞼板腺感染及化膿性淚腺炎等眼瞼及眼眶炎癥疾病的治療。方中龍膽能夠殺毒抑菌、瀉肝膽實火，可以治療肝火過盛引起的目赤目腫目痛。其主要成分為龍膽苦苷，龍膽苦苷主要通過抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[1]。梔子能用于清熱瀉火、涼血消腫解毒,可廣泛應(yīng)用于治療因血熱導(dǎo)致的急性鼻出血、眼腫痛。梔子苷是梔子的主要成分，梔子苷抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓、解熱作用突出[2]。黃芩主要有效成分為黃芩苷，黃芩苷有明顯抗菌作用[3]，機制有二：一是能有效的抑制細(xì)菌新的生物膜合成，致其繁殖減慢；二是使細(xì)菌生物膜的滲透性增加利于抗菌藥物進(jìn)入。黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷三種成分共同具有抗炎解毒作用，為本方治療眼部炎癥及感染的主要有效成分，含量測定選擇同時測定這三種成分,不僅操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，最重要的是能為本藥藥效是否良好提供標(biāo)準(zhǔn)，保證藥品質(zhì)量。本實驗使用的高效液相色譜法具備操作自動簡便、檢測靈敏、分離效率高和分離速度快等優(yōu)點，在生藥、復(fù)方中藥等復(fù)雜體系的成分分離分析中發(fā)揮重要作用。復(fù)方中藥中多指標(biāo)的同時測定能直接反映藥品的質(zhì)量的同時還能夠減少分析的成本，提升分析的準(zhǔn)確度。該制劑目前已完成前期成型工藝，為提高藥品的質(zhì)量控制要求，本實驗從主要成分的含量測定方面進(jìn)行研究，擬制定清火抗毒丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000(賽默飛世爾科技有限公司)，AR224CZ萬分之一電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)。

1.2 材料 黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201706)；龍膽苦苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110770-201716)；梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201718)。清火抗毒丸(巴彥淖爾市殘聯(lián)眼科醫(yī)院提供，批號20190103、20190105、20190107),經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)渠弼教授鑒定。甲醇為色譜純,水為超純水,其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；波長：254 nm。以下專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收實驗均使用此色譜條件。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷對照品適量溶于色譜甲醇，定容即得混標(biāo)溶液，其每1 mL對照品溶液中包括黃芩苷、龍膽苦苷、梔子苷分別為55 μg、44 μg和86 μg。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.2 g清火抗毒丸粉末于錐形瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定錐形瓶,密塞，超聲處理(250 W,40 kHz)30 min，放冷，重新稱定其重量,甲醇補足缺失重量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液[4]。

2.4 陰性對照溶液的制備 將本方各個藥材粉碎過篩，全方分別除去龍膽,梔子和黃芩按各自處方比混合，根據(jù)“2.3”項方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”、“2.3”、“2.4”項下溶液各10μL進(jìn)樣,相同保留時間下，供試品溶液在龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷相應(yīng)位置有色譜峰,陰性對照溶液相同位置未見干擾,表明該方法具有專屬性良好,結(jié)果如圖2所示。

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺龍膽樣品溶液；D.缺梔子樣品溶液；E.缺黃芩樣品溶液；1.龍膽苦苷A；2.梔子苷；3.黃芩苷圖2 清火抗毒丸高效液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項下溶液0.5、1、2、4、5 mL置5 mL容量瓶中，甲醇定容并搖勻，測定線性關(guān)系。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X，mg·mL-1) 為橫坐標(biāo)，作圖，分別得出龍膽苦苷的線性方程：Y=143.02X+0.0742(r=0.9999),梔子苷線性方程：Y=157.72X-0.0081(r=1),黃芩苷線性方程：Y=235.99X+0.4012 (r=0.9998)。龍膽苦苷在8.6～86 μg·mL-1、梔子苷在4.4～44 μg·mL-1、黃芩苷在 5.5～55 μg·mL-1與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取“2.2”項下溶液，進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷對照品的峰面積RSD依次為0.16%、0.08%和0.13%(n=6),結(jié)果顯示該儀器精密度良好[5]。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，記錄各峰面積，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD依次為0.66%,1.97%,0.47%(n=6)。表明樣品溶液放置24 h各成分含量穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 選同批次樣品(批號：20190103)，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，測定各峰面積，結(jié)果顯示龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷峰面積的RSD 分別為1.0%、1.4%、1.5%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗 取同批樣品6份(批號：20190103)，精密稱定，每份約0.1 g，分別加入龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對照品溶液1 mL(濃度依次為6.5、8、24.5 μg·mL-1)，測定峰面積，各成分平均加樣回收率分別為101.24%、98.64%、99.38%，RSD分別為1.06%、1.04%、0.45%(n=6)。

2.11 樣品含量測定 取3個批次的樣品(批號：20190103、20190105、20190107)，按照“2.3”項方法，制備供試品溶液平行樣3份，測定每批樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 三批清火抗毒丸樣品含量測定結(jié)果 (n=3，mg·g-1)

3 討論

3.1 選擇測定波長 紫外-可見分光光度儀測定結(jié)果顯示：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的最大吸收波長分別是270 nm、242 nm、276 nm。改變波長進(jìn)樣后，發(fā)現(xiàn)254 nm處同時測定含量時，各峰的分離度較好，基線較平，峰面積較大，所以選擇在254 nm下對三種成分進(jìn)行含量測定[6-8]。

3.2 流動相的選擇 用甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液作為兩種待選流動相,當(dāng)選用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，出峰時間較早，而且龍膽苦苷峰和梔子苷峰不能實現(xiàn)良好分離，并且基線不平穩(wěn)；當(dāng)采用甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫時，此條件下各峰分離很好，而且均符合藥典的要求，因此選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.3 提取溶劑和方法 首先對50%甲醇、70%甲醇和甲醇三種提取溶劑進(jìn)行考察，使用甲醇作提取溶劑時，提取出的供試品溶液中三種成分的綜合提取率最佳；采用不同時長超聲(15、30、60 min)處理時，發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min和60 min的供試品溶液中三種成分的提取率無明顯差異，其中超聲15 min時的提取率較低，因此選擇超聲30 min提取，操作簡便且能量消耗少。

本實驗通過綜合考量測定波長、色譜條件、提取工藝等可能影響含量檢定的各類因素，篩選出適合同時測定三種成分的HPLC法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠,此法可作為清火抗毒丸的質(zhì)量控制指標(biāo)。

4 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代檢測分析方法如高效液相色譜的不斷發(fā)展，復(fù)方中藥的研究也逐漸深入，分離、測定中藥有效成分，闡明中藥作用機理等工作正有序開展，并取得了可觀成果。復(fù)方中藥發(fā)揮藥效時通常是多種有效成分共同協(xié)作，可能是一味藥增強另一味藥的治療作用，或者是一味藥消除其他味藥的副作用，單獨測定一種主要有效成分通常不能很好控制復(fù)方藥的質(zhì)量。因此在復(fù)方中藥的質(zhì)量控制中多指標(biāo)成分的分離與測定具有特別重要的意義。在同一方劑中，復(fù)方中藥的體內(nèi)藥物動力學(xué)特征以及復(fù)方藥效受藥材中指標(biāo)成分影響，而配伍藥材的比例與其各自含量又顯著影響指標(biāo)成分的高低[9]。因此復(fù)方中藥配伍以后，各指標(biāo)成分的比例、含量不僅僅能夠反映藥物制劑的工藝水平，更重要的是能夠表征和確保復(fù)方中藥(及其制劑)的藥物療效。清火抗毒丸是民間應(yīng)用廣泛的復(fù)方中藥，其治療如上所述眼科疾病療效確切，但因其處方復(fù)雜，有效成分尚待分離確定，導(dǎo)致本藥生產(chǎn)過程中的質(zhì)控環(huán)節(jié)難以規(guī)范。本實驗建立HPLC法同時測定清火抗毒丸龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量, 通過方法學(xué)驗證,本實驗所建立的方法不僅簡單，而且可靠,此法用于清火抗毒丸的質(zhì)量控制將給制備和檢測工作帶來極大便利。清火抗毒丸仍有許多輔助發(fā)揮藥效的有效成分未被分離發(fā)掘，建立適當(dāng)分析方法來測定其他重要組分，并詳細(xì)研究其作用靶點、機制通路都將是后續(xù)研究的方向。