電流型酶電極生物傳感器抗可逆抑制劑干擾的測定方法

朱思榮，畢春元，杜祎，張金玲，高廣恒，張利群，趙曉華，楊艷

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所 山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103)

電流型酶電極生物傳感器是把具有生物活性的酶與電化學(xué)電極結(jié)合在一起的復(fù)合型傳感器，通常由過氧化氫電極和產(chǎn)過氧化氫的氧化酶組成，酶反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫在電極表面還原為水和氧氣，釋放電子，產(chǎn)生電極流。傳感器關(guān)鍵元件為具有催化活性的酶，通常是把酶固定化在載體膜上，再把膜緊貼在電化學(xué)電極上，也可把酶直接固定在電化學(xué)電極上。由于酶催化反應(yīng)只對其特定底物起作用，所以酶電極生物傳感器具有專一性好、反應(yīng)速度快，靈敏度高的優(yōu)點，不需要對待測樣品進行特殊處理，就能快速檢測樣品內(nèi)的特定成份。目前酶電極生物傳感器已廣泛應(yīng)用于臨床生化檢驗、食品分析、發(fā)酵檢測等領(lǐng)域。

酶電極生物傳感器由固定化酶和電化學(xué)電極組成，所以任何影響酶催化反應(yīng)和電化學(xué)電極電流大小的外部因素都會對測定分析形成干擾，影響儀器的分析測定精度。目前研究較多的是對電化學(xué)電極的干擾，因為一些具有氧化還原活性的小分子會在電極表面反應(yīng)，產(chǎn)生電極電流，影響測定的準(zhǔn)確性。Shitanda等[1]根據(jù)酶電極對干擾物和測定物具有不同響應(yīng)速度的特點，利用小波變換算法排除抗壞血酸對電流型酶電極生物傳感器的干擾。Serkan等[2]在葡萄糖流動注射分析系統(tǒng)中用樣品流過裝填不溶性NaBiO3的流動腔，使樣品基底中的氧化還原活性物質(zhì)如抗壞血酸、多巴胺、尿酸在到達(dá)測定電極之前轉(zhuǎn)化為無活性的氧化態(tài)，使樣品中的抗壞血酸干擾降低96%，多巴胺干擾降低86%，尿酸干擾降低98%。何原子等[3]以納米Au修飾煤基活性炭為電極固載葡萄糖氧化酶，該系統(tǒng)對0.05 mol/L的尿酸和抗壞血酸干擾因素未引起顯著電流反應(yīng)。由于酶活抑制劑的存在會顯著抑制酶的催化活性，酶傳感器也通常用于酶抑制劑的檢測，如用乙酰膽堿酯酶傳感器檢測可逆抑制劑石杉堿甲和加蘭他明[4]、毒扁豆堿[5]、黃曲霉毒素B1[6]和有機磷農(nóng)藥[7-9]，用酪氨酸酶傳感器檢測黃曲霉毒素M1[10]，用葡萄糖氧化酶測定生物毒性痕量金屬離子[11-12]，用酪氨酸酶和葡萄糖氧化酶雙酶檢測雙酚A(BPA)、苯酚、Cr(III)、葡萄糖和Cr(VI)[13]。但對于抗酶活抑制劑干擾的處理方法目前尚未見報道。

1 電流型酶電極生物傳感器測定原理

酶是一種特殊的具有生物活性的蛋白質(zhì)，其生物活性隨保存時間的增長或測定樣品次數(shù)的增加會逐步降低，但這是一個很緩慢的過程，短時間(數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘)內(nèi)其活性變化很小，可以忽略不計。酶電極生物傳感器的應(yīng)用正是基于酶的這一特點。通常在用酶電極檢測前，先用標(biāo)樣連續(xù)檢測酶電極的響應(yīng)電流，直到酶電極的響應(yīng)電流基本恒定(誤差小于分析測定要求)，然后再檢測被測樣品，根據(jù)酶電極對被測樣品的響應(yīng)電流，與標(biāo)樣比較，計算出被測樣品的濃度。在電化學(xué)電極表面酶反應(yīng)產(chǎn)物是一個生成與擴散的平衡狀態(tài)[14]，實際濃度與產(chǎn)物生成速度(即酶反應(yīng)速度)成正比。根據(jù)酶促反應(yīng)的米氏定律，酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度V與反應(yīng)底物濃度S的關(guān)系為：

(1)

因為反應(yīng)速度V與傳感器電極電流成正比關(guān)系，可以導(dǎo)出酶電極響應(yīng)電流與底物濃度的關(guān)系為：

(2)

其中:C為電極響應(yīng)電流;a為常數(shù),與Vmax成一定的比例關(guān)系;b=Km即米氏常數(shù);S為底物濃度。

酶電極的線性校正就是通過定標(biāo)時的標(biāo)樣濃度及響應(yīng)電流、線性校正時的標(biāo)樣濃度及響應(yīng)電流這兩組數(shù)據(jù)，按式(2)求出常數(shù)a和b，測定時再通過樣品響應(yīng)電流及常數(shù)a和b，計算出測定樣品的濃度。

2 抗抑制劑干擾實現(xiàn)

在測定底物中存在酶活性抑制劑的情況下，由于標(biāo)樣定標(biāo)時不存在酶活抑制劑，酶活較高，而在樣品測定中因酶活抑制劑的存在，酶活性較低，這樣定標(biāo)過程和測定過程酶活基本不變這一測定的基本條件不再存在，所以用常規(guī)法測定無法得到準(zhǔn)確的分析結(jié)果。只有使酶傳感器的定標(biāo)過程和測定過程處于同一酶反應(yīng)的環(huán)境中，才能保證傳感器的酶活基本不變。本文提供的抗干擾測定方法就是用標(biāo)樣在樣品測定環(huán)境中對酶活進行二次標(biāo)定，消除酶活抑制劑對測定過程的影響。具體測定過程如下：

測定時先按常規(guī)方法對酶電極進行定標(biāo)。如有必要在定標(biāo)完成后對酶電極進行校線性操作，確保在標(biāo)樣濃度范圍內(nèi)，酶電極的測定結(jié)果與樣品濃度一致。定標(biāo)完成后進行測定操作，測定分兩步進行，第一步僅取樣品測定，為防止在第二步測定中樣品濃度超限，測定時樣品的進樣量改為常規(guī)法的一半，反應(yīng)結(jié)束后獲得測定結(jié)果R1，第二步用與第一步等量的樣品加上與樣品等量的標(biāo)樣進行測定，獲得測定結(jié)果R2。

如樣品中有酶活抑制劑存在，則測定結(jié)果會明顯偏低?？紤]到進樣量僅為正常定標(biāo)時的一半，測定結(jié)果R1與實際樣品濃度X的關(guān)系為：

(3)

其中K為為酶活抑制系數(shù)。

第二步測定因為所加的樣品量與第一步相同，所以反應(yīng)系統(tǒng)中酶活抑制劑含量與第一步測定相同，酶活抑制系數(shù)可視為不變。測定結(jié)果R2與實際樣品濃度X的關(guān)系為：

(4)

其中St為標(biāo)樣濃度，根據(jù)式(3)和(4)可以算出：

(5)

(6)

兩次測定結(jié)束后，根據(jù)兩次測定結(jié)果R1和R2，按式(5)計算出抑制系數(shù)K，再按式(6)計算出實際樣品濃度X。因抗干擾測定方法中每個待測物的抑制系數(shù)不同，所以在正常定標(biāo)和校線性后，每個樣品至少要測定兩次才能獲得分析結(jié)果，雖然測定速度慢一些，但在樣品中有酶活抑制劑干擾的情況下，這種測定方法去除了抑制劑的影響，測定結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠。

3 酶抑制劑對測定的影響及抗抑制劑干擾法測定實驗

3.1 實驗試劑與儀器

3.2 用常規(guī)分析方法測定含(NH4)2SO4的標(biāo)準(zhǔn)樣品

圖1 (NH4)2SO4濃度對葡萄糖、谷氨酸生物傳感器分析結(jié)果的影響Fig.1 Influence of (NH4)2SO4 concentration on the analysis result of glucose and glutamic acid biosensors

表1 含(NH4)2SO4樣品對葡萄糖、谷氨酸生物傳感器的影響(10次測定結(jié)果)

3.3 用抗抑制劑干擾法分析含離子樣品

測定前先按常規(guī)法用標(biāo)準(zhǔn)樣品進行酶活定標(biāo)，然后用1/2濃度標(biāo)樣對傳感器校線性，確保在標(biāo)樣濃度范圍內(nèi)傳感器對樣品測量有很好的線性關(guān)系。定標(biāo)和校線性按常規(guī)分析法進行。進樣量為20 μL。

完成正常定標(biāo)和校線性后用抗干擾法測定干擾樣品，為使測定結(jié)果不超線性范圍，樣品量改為10 μL，測定分兩次進行，第一次向反應(yīng)池注入10 μL待測樣品，待反應(yīng)結(jié)束后獲得一組測定結(jié)果，因為進樣量是常規(guī)法的一半，所以該結(jié)果乘2即為按常規(guī)測定的結(jié)果，第二次向反應(yīng)池注入10 μL待測樣品加10 μL標(biāo)樣。待反應(yīng)完成，再次獲得一組測定數(shù)據(jù)。根據(jù)兩次測定結(jié)果按式(5)、(6)計算出抗干擾校正結(jié)果。第二次測定時樣品和標(biāo)樣的總進樣量為20 μL，只要待測樣品濃度不超標(biāo)樣太多，測定就不會超出傳感器線性范圍。

圖5 不同濃度抑制劑下葡萄糖、谷氨酸重復(fù)測定變異系數(shù)比較Fig.5 Comparison of the coefficient of variation of glucose and glutamic acid for repeated determination under different concentrations of inhibitors

表2 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為10 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣的重復(fù)測定結(jié)果

從圖2～4抗干擾校正后的結(jié)果可見，雖然用本方法重復(fù)測定的變異系數(shù)相對大，但抗酶活抑制劑的干擾效果明顯，分析結(jié)果更接近實際濃度。在檢測存在酶活抑制劑的樣品時可有效提高分析精度，降低分析誤差。由于本方法在第二次測定中使用標(biāo)樣計算抑制系數(shù)，也有同定標(biāo)相似的效果，測定過程酶活少許改變不會影響分析結(jié)果，測定過程可以適當(dāng)延長定標(biāo)的時間間隔。

表3 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為5 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣的重復(fù)測定結(jié)果

表4 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為2 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣的重復(fù)測定結(jié)果

圖2 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為10 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果比較Fig.2 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 10 mmol/L (NH4)2SO4

圖3 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為5 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果比較Fig.3 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 5 mmol/L (NH4)2SO4

圖4 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為2 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果比較Fig.4 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 2 mmol/L (NH4)2SO4

4 結(jié)語

酶電極生物傳器以其測定速度快、專一性好、成本低等優(yōu)勢在醫(yī)療、發(fā)酵、食品、體育訓(xùn)練等多個領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。對于測定對象成份相對穩(wěn)定的試樣，如人體血液樣品，干擾是可預(yù)期的,并多為電極干擾,可以采取針對性的防干擾措施，獲得高精度測定結(jié)果。但在工業(yè)領(lǐng)域中，測定對象極其復(fù)雜，如發(fā)酵液樣品，在發(fā)酵后期菌體量極大，各種代謝產(chǎn)物復(fù)雜，其中極有可能有未知的酶活抑制劑，常規(guī)檢測方法獲得的測定結(jié)果偏差較大，限制了酶電極在這些領(lǐng)域中的應(yīng)用。本文設(shè)計的測定方法可有效消除酶抑制劑對測定結(jié)果的影響，降低酶電極生物傳感器在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用中的測定誤差，有較好的應(yīng)用前景。