培養(yǎng)條件對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

湯鳴強 鄭永彬 潘思萍 黃 潔

培養(yǎng)條件對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

湯鳴強1, 2鄭永彬3潘思萍1黃 潔3

（1. 福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清 350300；2. 現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建 福清 350300；3. 福建容益菌業(yè)科技研發(fā)有限公司，福州 350100）

采用錐形瓶液體培養(yǎng)方式，以廣葉繡球菌（）為試驗材料，通過考察菌絲生物量及菌球大小評分，研究培養(yǎng)時間、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液起始pH及搖瓶裝液量對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響。單因素綜合試驗結(jié)果為，適宜培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間12天，轉(zhuǎn)速210 r/min，培養(yǎng)溫度26 ℃，pH 3.5，裝液量75 mL，該條件下所形成的菌絲球均勻細小，菌絲生物量大，菌絲萌發(fā)點多，是良好的液體菌種材料。

廣葉繡球菌；液體培養(yǎng)條件；菌種質(zhì)量

繡球菌（）又名繡球菇、花瓣覃、花椰菜菌，是食藥兩用菌[1]，其突出特點是含有40%以上的β-葡聚糖，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗菌抗氧化等多種生物學活性，可促進傷口愈合，增強造血功能，有廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。

近年來，液體菌種所具有的接種方便、生產(chǎn)周期短、菌絲萌發(fā)點多、菌齡一致以及便于連續(xù)化自動化操作等優(yōu)點，已獲得業(yè)內(nèi)人士的廣泛認同，發(fā)達國家為提高產(chǎn)品品質(zhì)和市場競爭力，已普遍采用液體菌種進行食用菌的周年化生產(chǎn)[5-6]。我國食用菌栽培仍以固體制種為主，僅杏鮑菇、金針菇和蟹味菇等品種的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)采用液體菌種[7]。繼日本、韓國之后，我國于2010年底在福建省首次實現(xiàn)了繡球菌工廠化栽培[8]，由于液體培養(yǎng)條件下繡球菌生長較為緩慢，國內(nèi)相關(guān)研究主要關(guān)注固體培養(yǎng)方式[9]。

本課題以廣葉繡球菌（）為供試菌種，采用液體培養(yǎng)方式，考察培養(yǎng)時間、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液起始pH、搖瓶裝液量等因素對菌絲生物量的影響，并結(jié)合感觀指標，評價不同條件下的液體菌種生長情況，為繡球菌液體菌種的大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種。廣葉繡球菌（）母種由福建容益菌業(yè)科技研發(fā)有限公司提供。

（2）培養(yǎng)基配方。母種培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，酵母膏1，復合維生素B10.01，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨4，磷酸二氫鉀4，硫酸鎂2，玉米漿1.5，pH 自然。

（3）主要儀器。NRY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；BS224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-IFD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PH-100型筆式pH測試筆，上海力辰儀器科技有限公司；LDZX-50KB型蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀室儀器開發(fā)有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

（1）菌種活化。在無菌條件下，用接種鏟取一塊供試菌種接種于母種培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)15天，觀察菌絲長勢，待用。

（2）菌絲干重測定。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液樣品于8 000 r/ min下離心10 min，收集沉淀物，用去離子水洗滌3次，置于鼓風干燥箱中，80 ℃烘干至恒重，測定菌絲體干重（g/L）。

（3）菌球大小評分。參照胡衛(wèi)紅[10]的試驗方法。將繡球菌液體菌種在不同條件下培養(yǎng)一段時間后，觀察測定菌球大小并給予評分，滿分5分，分數(shù)越高，說明菌球越小、質(zhì)量越好（表1）。

表1 菌球大小評分標準

表2 單因子試驗設(shè)計表

（4）培養(yǎng)條件對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響。基礎(chǔ)液體發(fā)酵條件設(shè)定為培養(yǎng)時間10天，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度26 ℃，裝液量100 mL/250mL，pH自然。在此基礎(chǔ)上，通過改變單一因素設(shè)計試驗（表2），其他條件與基礎(chǔ)條件一致。測定繡球菌菌絲干重，并對菌球大小評分，考察培養(yǎng)條件對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響。

（5）數(shù)據(jù)處理與分析。采用Oringin 2018作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在spss25.0下完成，利用LSD多重比較法檢測處理間差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為＜0.05。數(shù)據(jù)為平均值±標準差，不同字母表示處理間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

絲狀真菌液體培養(yǎng)菌體的形態(tài)不僅受基因控制，也受培養(yǎng)條件的影響。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲干重呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，而菌球大小評分則呈逐漸增高的趨勢。培養(yǎng)12天時，菌絲干重最大，為1.596±0.007 g/L，菌球大小評分1.31。繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，菌絲干重逐漸降低，菌球大小評分差異不顯著。綜合考慮，繡球菌液體菌種培養(yǎng)時間以12天較合適。

2.2 搖瓶轉(zhuǎn)速對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

液體發(fā)酵中，菌球直徑和菌絲長度均會隨轉(zhuǎn)速的增加而減小。轉(zhuǎn)速過高，有可能降低菌絲體的成球速度甚至無法成球，進而影響到菌體生長和代謝產(chǎn)物的積累。由圖2可以看出，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，菌絲干重呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，而過高轉(zhuǎn)速對菌球大小評分不利。當轉(zhuǎn)速為210 r/min和240 r/min時，菌絲干重分別為1.582±0.007 g/L和1.597±0.141 g/L，兩者差異不顯著。但轉(zhuǎn)速為210 r/min時，菌球評分最高，菌球表現(xiàn)均勻、細小，適合用于接種。

2.3 培養(yǎng)溫度對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

培養(yǎng)溫度明顯影響繡球菌的生長（圖3）。當培養(yǎng)溫度為28 ℃時，菌絲干重為2.016±0.057 g/L，達到最大值，菌球評分為2.19；培養(yǎng)溫度為26 ℃時，菌絲干重為1.819±0.095 g/L，菌球評分為3.38。盡管菌絲干重26 ℃條件下顯著低于28 ℃條件，但前者的菌球評分顯著高于后者，菌球小，萌發(fā)點多，生活力強。綜合考慮，培養(yǎng)溫度宜選擇26 ℃。

圖1 不同培養(yǎng)時間繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖2 不同搖瓶轉(zhuǎn)速繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖3 不同培養(yǎng)溫度繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖4 不同pH繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

2.4 pH對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

pH不僅影響微生物液體培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解、傳遞和相關(guān)代謝酶的活性，而且對形態(tài)也有重要影響。有研究報道，冬蟲夏草菌絲體液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液pH為6時，可形成直徑為1.8 mm左右、大小均一且表面光滑的菌絲球；培養(yǎng)液pH為4.0～5.0時，菌絲球變得大小不一；而培養(yǎng)液pH為8.0～9.0時則無法成球[11]。

本試驗結(jié)果顯示，pH 3.5時，菌絲干重為1.751±0.028 g/L，達到最大值（圖4），與其他處理比較差異顯著。在該條件下，菌球評分為3.91表現(xiàn)均勻細小，菌絲萌發(fā)點多。

2.5 裝液量對繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

裝液量明顯影響繡球菌的菌種培養(yǎng)質(zhì)量（圖5）。在本試驗設(shè)計范圍內(nèi)，菌絲干重和菌球大小評分隨裝液量的增加呈先升后降的變化趨勢。當裝液量為100 mL和125 mL時，菌絲干重分別為1.724± 0.023 g/L和1.697±0.027 g/L，兩者間差異不顯著，但均顯著大于其他處理；菌球大小評分則以裝液量為75 mL時最高，為3.61，顯著高于其他處理。綜合考慮菌球質(zhì)量與菌絲生物量，實際培養(yǎng)過程中宜選擇75 mL。

圖5 不同搖瓶裝液量繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

3 小結(jié)與討論

菌種生產(chǎn)是食用菌生產(chǎn)的首道工序，其重要性不言而喻。液體菌種有著固體菌種不可比擬的優(yōu)越性，是當前食用菌行業(yè)研究應(yīng)用的重點和熱點。目前我國已頒布實施的食用菌菌種質(zhì)量標準中，只規(guī)定了固體菌種標準，尚無統(tǒng)一的檢測液體菌種活力的方法和質(zhì)量標準。建立以菌絲體干重、菌絲球大小和密度為指標的液體菌種質(zhì)量檢測體系是液體菌種工廠化生產(chǎn)的發(fā)展態(tài)勢[12]。

在液體發(fā)酵過程中，絲狀真菌以絲狀、絮狀、塊狀、刺突狀及球狀等形態(tài)存在，培養(yǎng)條件是影響菌體形態(tài)的重要因素[13]。有學者認為，球形菌體能使發(fā)酵液表現(xiàn)出較低的粘度，有利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞[14]。Carlsen等研究發(fā)現(xiàn)，較低pH（3.0～3.5）時，米曲霉（）主要以松散絲狀形態(tài)存在，而隨pH提高會出現(xiàn)球形菌體，當pH大于6.0時，絲狀菌體全部消失，菌球逐漸變大[15]。合適的攪拌速度是菌絲球形成的必要條件之一，速度過低或過高會導致菌絲球直徑過大而松散，或降低菌絲體的成球速度甚至無法成球[16-17]。高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力通過切除菌球表面的刺突部分，抑制菌球直徑增大，使菌球變得光滑[18]。

繡球菌的工廠化生產(chǎn)雖已告成功，但一些問題仍困擾其發(fā)展與壯大，如勞動強度大、周期長、制種工藝不成熟等[19]。而應(yīng)用液體菌種則能縮短栽培周期，提高菌種質(zhì)量，增加接種效率[20]。本研究根據(jù)菌絲干重與菌球大小評分得出，較合適的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)時間12天，溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速210 r/min，pH 3.5，裝液量75 mL。該條件下形成的菌絲球均勻細小，菌絲萌發(fā)點多，是良好的液體菌種材料。不過這一結(jié)果僅是單因素試驗結(jié)果，對各因素間的交互影響如何，尚缺試驗驗證。

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Effects of culture conditions on liquid spawn quality of

Tang Mingqiang1, 2Zheng Yongbin3Pan Siping1Huang Jie3

(1. School of Ocean and Biochemical Engineering, Fuqing Branch of Fujian Normal University, Fuqing, Fujian 350300, China; 2. Engineering Research Center of Modern Facility Agriculture of Fujian University, Fuqing, Fujian 350300, China; 3. Fujian Rongyi Medicinal Fungus Technology R. & D. Co., Ltd., Fuzhou, Fujian 350100, China)

To meet the purpose of liquid spawn application in large-scale edible mushroom production, taking dry weight of mycelial biomass and mycelial ball diameter score as response value, the study was carried out to optimize the effects of liquid culture conditions (incubation time, temperature, rotational speed, initial pH value and volume of medium in flask) on the quality ofliquid spawn. The results showed that the optimum quality of liquid spawn could be attained along with evenly small mycelial ball, high mycelial biomass and abundant development under the incubation conditions of incubation time 12 d , rotational speed 210 r/min, temperature 26 ℃, initial pH value 3.5, and the volume of medium 75 mL.

; liquid culture conditions; liquid spawn quality

S646

B

2095-0934（2021）04-313-05

福州市科技項目-星火項目“繡球菌液體發(fā)酵工藝優(yōu)化研究” {榕財教（指）[2019]52號}

湯鳴強（1966—），男，博士，教授，主要從事微生物科學技術(shù)研究。E-mail：mqt-1022@163.com。