不同嫩度青磚茶改善小鼠胃腸道功能研究

蘇 丹，唐 飛，張善明，陳玉瓊，倪德江

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

由于受飲食規(guī)律、飲食結(jié)構(gòu)、社會(huì)因素及心理因素的影響，越來(lái)越多人患有胃腸健康相關(guān)的疾病。胃腸道的健康尤其是腸道菌群的平衡影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、能量供應(yīng)、機(jī)體免疫等功能的運(yùn)行，是影響人體健康的重要因素［1，2］。治療胃腸疾病的藥物雖然有一定的特效性，但長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生依賴性、抗藥性以及對(duì)肝臟易產(chǎn)生副作用等問(wèn)題，因此尋求安全、有效、天然的“胃腸調(diào)節(jié)劑”是預(yù)防和治療相關(guān)疾病的新途徑。

青磚茶屬于六大基本茶類之一的黑茶，為后發(fā)酵茶，原產(chǎn)于湖北省赤壁市羊樓洞，歷史悠久，源于唐，盛于明清［3］。曬青毛茶經(jīng)渥堆發(fā)酵、干燥、再拼配、蒸壓成型、低溫長(zhǎng)烘、陳化等工序加工成為青磚茶，優(yōu)質(zhì)的青磚茶香氣純正，有木香或菌香，滋味醇和，湯色紅（黃）橙明亮，葉底青褐［4］。青磚茶不僅可以生津解渴、利尿解毒、消臭除菌，還具有減脂、降血脂、抗氧化、改善腸道功能等生理功效［5-7］。長(zhǎng)期飲用青磚茶可以一定程度上預(yù)防胃腸疾病。然而，由于茶樹(shù)對(duì)氟的吸收特性，茶葉的含氟量隨成熟度的增加而增加，以成熟新梢為原材料的青磚茶含氟量往往超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（0.3‰），高的達(dá)到0.8‰以上［8-10］，而長(zhǎng)期多量飲用含氟量高的茶葉易導(dǎo)致人體內(nèi)氟元素過(guò)量而引發(fā)氟斑牙、氟骨癥等疾病［11］。研究表明，除選用低氟茶樹(shù)品種［12］、改善栽培條件、改變加工方式［13］等方法外，還可以通過(guò)降低原料的成熟度［14］來(lái)降低青磚茶的含氟量，但有關(guān)青磚茶嫩度提高后是否影響其功能的研究較少。

改善腸道功能是青磚茶最為重要的活性之一。前期已經(jīng)就不同年份青磚茶［15］、不同發(fā)酵程度青磚茶［16］對(duì)小鼠胃腸道功能的改善作用進(jìn)行了研究，但仍缺乏不同嫩度青磚茶對(duì)改善胃腸道功能的研究。因此，本研究通過(guò)測(cè)定小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率以及腸道菌群數(shù)量，研究了不同嫩度青磚茶對(duì)小鼠胃排空及小腸推動(dòng)功能和腸道菌群的作用，并分析了青磚茶的生化成分與胃腸道功能的相關(guān)性，以探明嫩度對(duì)青磚茶改善腸道功能的影響，為創(chuàng)新青磚茶原料采收技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

恩施州宣恩縣伍臺(tái)昌臣茶業(yè)有限公司生產(chǎn)的曬青毛茶，嫩度為純單芽、一芽二三葉、一芽四五葉。渥堆試驗(yàn)在人工氣候箱（RXZ-328A型）進(jìn)行，掌握渥堆葉含水量38%、溫度45℃、濕度85%、渥堆時(shí)間18 d。渥堆結(jié)束后在SKFG-01型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，得到單芽、一芽二三葉、一芽四五葉不同嫩度的青磚茶原料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康成年昆明種小鼠，體重（25±1）g，SPF級(jí)，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。

1.3 藥品及試劑

營(yíng)養(yǎng)性半固體糊的制備：10 g羧甲基纖維素鈉加16 g奶粉、8 g蔗糖、8 g淀粉、5 g活性炭溶解于250 mL蒸餾水中攪拌均勻制成300 mL（約300 g）半固體糊狀物，冰箱冷藏，使用前2 h取出，恢復(fù)至室溫。腸道菌群培養(yǎng)基及廠家如表1所示。

表1 腸道菌群培養(yǎng)基及廠家

1.4 主要設(shè)備

AW220型電子分析天平、RXZ-328A型人工氣候箱、SKFG-01型鼓風(fēng)干燥箱、巨輪牌FZ102型植物粉碎機(jī)、SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、DNP系列電熱恒溫培養(yǎng)箱、厭氧盒、高壓滅菌鍋、常規(guī)玻璃儀器等。

1.5 方法

1.5.1 不同嫩度青磚茶水提物的主要化學(xué)成分測(cè)定 茶多酚總量采用福林酚法［17］，兒茶素組分、咖啡堿、有機(jī)酸含量采用高效液相色譜法（HPLC），氨基酸總量檢測(cè)采用茚三酮顯色法［18］，水浸出物含量采用重量法［19］，可溶性糖含量采用蒽酮比色法［20］，茶黃素、茶紅素和茶褐素含量采用系統(tǒng)法［21，22］。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

兒茶素組分及咖啡堿含量檢測(cè)的HPLC條件：用70%甲醇溶解在70℃水浴中浸提樣品10 min，3 000 r/min離心10 min，過(guò)0.45 μm濾膜后待測(cè)。HPLC條件：LC1200，Agilent，USA；色譜柱，Agilent TC-C18（4.6 μm×250 mm）；進(jìn)樣量5 μL；流速1 mL/min；溫度35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相A，超純水（0.1%甲酸）；流動(dòng)相B，甲醇（0.1%甲酸）；梯度洗脫條件，0～10 min，100% A；10～20 min，68% A和32% B；20～30 min，100%A。

有機(jī)酸組分含量檢測(cè)的HPLC條件：用蒸餾水在100℃水浴中浸提20 min，脫脂棉過(guò)濾，用微孔濾膜過(guò)濾。色譜柱：AgilentHB-C18，色譜條件：柱溫30℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相A：KH2PO4，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫條件，0～5 min，99% A，1%B；5～25 min，97%A，3%B；25～30 min，99%A，1%B。

1.5.2 青磚茶水提物的制備 取青磚茶茶粉，以茶水比1∶15微沸提取30 min，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，分別配制成不同嫩度青磚茶茶湯。

1.5.3 青磚茶水提物劑量的選擇 參考黑茶吸收試驗(yàn)，人體推薦量為每人10 g/d（成人60 kg），試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量為人體推薦量的10倍（1 667 mg/kg）［23］，另設(shè)正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

1.5.4 不同嫩度青磚茶對(duì)正常小鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能的影響 小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，開(kāi)始正式試驗(yàn)。取健康小鼠40只，全為雄性，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單芽組、一芽二三葉組、一芽四五葉組，每組10只。每組按每只0.15 mL/10 g分別灌胃，1次/d，青磚茶水提物連續(xù)給15 d；正常對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水。末次灌胃前24 h，小鼠禁食不禁水。第15天給予青磚茶水提物后30 min，每只小鼠灌胃5%的炭末混懸液（用l%的羧甲基纖維素鈉配制）0.8 mL。灌營(yíng)養(yǎng)性半固體糊25 min后，小鼠脫頸椎處死，取胃，濾紙拭干后稱全重，沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干稱胃凈重。胃全重和胃凈重的差值為胃殘留物重，以此與所灌半固體糊的重量百分比為胃內(nèi)殘留率（%）。迅速取出小鼠的胃及回盲腸部位的整段小腸，剪取上端自幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，輕輕剝離后不加牽引直鋪于白紙上，鋪直后測(cè)量幽門(mén)至炭末前沿的距離，以幽門(mén)至炭末前沿的距離占幽門(mén)至回盲部全長(zhǎng)的百分率為炭末推進(jìn)百分率（%）。

胃內(nèi)容物殘留率=（胃全重-胃凈重）/半固體糊重×100%

炭末推進(jìn)百分率=（炭末移動(dòng)距離/腸總長(zhǎng)度）×100%

1.5.5 不同嫩度青磚茶對(duì)正常小鼠腸道菌群的影響 無(wú)菌采集小鼠新鮮糞便0.1～0.4 g，置于己稱重的干燥滅菌小試管（編號(hào)為10-1）中，充分振蕩，直至糞便分散均勻，再依次10倍稀釋至10-9，4 h內(nèi)完成。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的稀釋度，分別取1 mL接種到各類選擇性培養(yǎng)基上，3個(gè)重復(fù)。EMB培養(yǎng)基和膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基放入37℃需氧培 養(yǎng)24～48 h后 計(jì) 數(shù)，BBL培 養(yǎng) 基 及MRS培 養(yǎng) 基37℃厭氧培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)，涂片分析計(jì)算各菌群每克糞便中菌落形成數(shù)，結(jié)果以對(duì)數(shù)表示（lgCFU/g）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)處理分析。SPSS 18.0試驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間用兩兩比較差異法，同列不同大小寫(xiě)字母分別表示在0.01、0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩度青磚茶主要品質(zhì)成分測(cè)定結(jié)果

青磚茶主要生化成分含量因毛茶原料的嫩度不同而具有一定的差異。由表2可知，單芽青磚茶的游離氨基酸含量、茶多酚含量最高，與一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶存在極顯著差異（P＜0.01），而其茶褐素含量與一芽四五葉青磚茶差異極顯著（P＜0.01），與一芽二三葉青磚茶無(wú)顯著差異。一芽二三葉青磚茶的可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素含量最高，極顯著高于單芽青磚茶和一芽四五葉青磚茶（P＜0.01）。

表2 不同嫩度青磚茶水提物的主要化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

由表3可知，兒茶素組分和咖啡堿含量在不同嫩度青磚茶中均存在差異。在3種不同嫩度青磚茶中均未檢出GC和GCG，在一芽四五葉青磚茶中均未檢出C、ECG、EC，在單芽青磚茶中未檢出CG。一芽二三葉青磚茶的EGCG、C、ECG、EC含量均高于單芽青磚茶和一芽四五葉青磚茶，而一芽四五葉青磚茶的CG含量高于一芽二三葉青磚茶。隨青磚茶原料成熟度增加，EGC含量極顯著增加，咖啡堿含量極顯著減少。

表3 不同嫩度青磚茶兒茶素和咖啡堿含量測(cè)定結(jié)果 （單位：mg/g）

由表4可知，有機(jī)酸組分及其含量在不同嫩度的青磚茶中均存在差異。在3種不同嫩度青磚茶中均未檢出酒石酸、α-酮戊二酸、乙酸，在一芽四五葉青磚茶中富馬酸、琥珀酸也未檢出。單芽青磚茶的奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒(méi)食子酸、富馬酸含量最高，且前4種有機(jī)酸含量與其他嫩度青磚茶具有極顯著差異（P＜0.01），一芽二三葉青磚茶的草酸、琥珀酸含量最高，一芽四五葉青磚茶的蘋(píng)果酸含量最高。

表4 不同嫩度青磚茶有機(jī)酸組分含量測(cè)定結(jié)果 （單位：mg/g）

2.2 不同嫩度青磚茶水提物對(duì)小鼠胃排空的影響

由表5可見(jiàn)，在給予小鼠連續(xù)灌胃不同嫩度青磚茶水提物15 d后，小鼠的胃排空能力發(fā)生了明顯變化。與正常對(duì)照組比較，單芽組、一芽二三葉組和一芽四五葉組胃內(nèi)容殘留率分別減少了26.37%、23.02%、9.58%。從不同嫩度組間差異來(lái)看，單芽組與一芽二三葉組差異不顯著，與一芽四五葉青磚茶差異顯著（P＜0.05），而空白對(duì)照組和一芽四五葉組差異不顯著。結(jié)果表明，不同嫩度青磚茶均能降低胃殘留率，促進(jìn)小鼠胃排空作用，以單芽青磚茶的效果最佳。

表5 不同嫩度青磚茶水提物對(duì)小鼠胃排空的影響

2.3 不同嫩度青磚茶水提物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響

由表6可見(jiàn)，在給予小鼠連續(xù)灌胃不同嫩度青磚茶水提物15 d后，小鼠的小腸推進(jìn)能力發(fā)生了明顯變化。與空白對(duì)照組相比較，單芽組、一芽二三葉組、一芽四五葉組小腸推進(jìn)率均顯著提高，分別提高了56.73%、37.47%、30.72%。從不同嫩度組間差異來(lái)看，單芽組與一芽二三葉組、一芽四五葉組有顯著性差異，而一芽二三葉組和一芽四五葉組無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，單芽、一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶均能提高小腸推進(jìn)率，顯著促進(jìn)小腸的蠕動(dòng)作用，且以單芽青磚茶效果最好。

表6 不同嫩度青磚茶水提物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響

2.4 不同嫩度青磚茶調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群作用的影響

由表7可見(jiàn)，在連續(xù)給予小鼠不同嫩度青磚茶15 d后，小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量均發(fā)生了明顯變化。與空白對(duì)照組相比，單芽、一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶均對(duì)小鼠腸道內(nèi)腸桿菌、腸球菌的生長(zhǎng)繁殖功能有明顯的抑制作用，對(duì)小鼠腸道內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖功能有顯著的促進(jìn)作用，且兩種作用均以單芽青磚茶的效果最好。

表7 不同嫩度青磚茶對(duì)小鼠腸道菌群數(shù)量的影響 （單位：lgCFU/g）

2.5 不同嫩度青磚茶主要理化成分與小鼠胃腸道功能相關(guān)性分析

如表8所示，小鼠胃殘留率、腸桿菌、腸球菌與不同嫩度青磚茶游離氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡堿、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒(méi)食子酸、有機(jī)酸總量極顯著負(fù)相關(guān)，而與蘋(píng)果酸、EGC顯著正相關(guān)；小鼠小腸推進(jìn)率、乳桿菌、雙歧桿菌與不同嫩度青磚茶氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡堿、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒(méi)食子酸極顯著正相關(guān)，與蘋(píng)果酸、EGC顯著負(fù)相關(guān)；可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、茶褐素、EGCG、兒茶素總量、草酸等與小鼠胃腸道功能各指標(biāo)參數(shù)均無(wú)相關(guān)性。

表8 不同嫩度青磚茶主要理化成分與小鼠胃腸道功能相關(guān)性分析

3 討論

人類消化系統(tǒng)中含有龐大的正常菌群，菌群的組成十分復(fù)雜，有高達(dá)1 000多種不同類型的細(xì)菌及其他微生物群落。除了常見(jiàn)的胃腸道疾病，受人類腸道微生物菌群的直接或間接影響而發(fā)生的疾病有：Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈硬化、肥胖癥、骨質(zhì)疏松、腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、精神疾病、癌癥等［24］?？梢?jiàn)腸道菌群與人體之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，貫穿于人體各種生理活動(dòng)和病理過(guò)程，已成為人體不可或缺的一部分，腸道健康深刻影響著人體的健康。青磚茶被證明具有抑制腸道內(nèi)有害菌的增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群和調(diào)整腸道紊亂的作用［2］，可作為天然的胃腸調(diào)節(jié)劑。

不同嫩度的青磚茶因?yàn)樯煞值慕M成和含量不同，對(duì)小鼠胃腸功能的影響也不同。從胃排空、腸推進(jìn)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3種嫩度的青磚茶均能促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)，以單芽青磚茶的效果最好；從灌胃小鼠青磚茶水提物前后的四大類微生物菌群變化情況中發(fā)現(xiàn)，3種嫩度的青磚茶均能促進(jìn)有益菌雙歧桿菌、乳桿菌的增殖，抑制有害菌腸桿菌和腸球菌的增殖，且以促進(jìn)雙歧桿菌和抑制腸桿菌效果尤為顯著，以單芽青磚茶的效果最好，與胃排空試驗(yàn)和小腸推進(jìn)試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。結(jié)果表明，青磚茶對(duì)小鼠胃腸功能的影響與原料嫩度有關(guān)，原料越嫩，改善小鼠胃腸道功能效果越好，以單芽青磚茶效果最好。

青磚茶的生化成分組成與原料嫩度、微生物［2，25］有關(guān)，不同的有效成分均會(huì)對(duì)胃腸功能的調(diào)節(jié)作用造成影響。李鵬等［26］通過(guò)給仔豬飼喂常規(guī)日糧（對(duì)照組）、添加0.1%磷酸型酸化劑A、0.3%磷酸型酸化劑A、0.1%乳酸型酸化劑B和0.3%乳酸型酸化劑B日糧，測(cè)定大腸微生物菌群。結(jié)果表明，添加磷酸型酸化劑A和乳酸型酸化劑B都可以顯著降低仔豬盲腸大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量（P＜0.05），增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量（P＜0.05）。吳根梁等［27］將從陳放1年和7年的茯磚茶中提取純化的茶多酚提取物加入到含有65歲老年人的腸道菌群混合培養(yǎng)基中進(jìn)行體外靜態(tài)厭氧培養(yǎng)，測(cè)定茶多酚和短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量，并進(jìn)行腸道菌群的高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明7年陳茯磚茶的茶多酚類比1年陳茯磚茶的茶多酚類更有益于改善老年人的腸道菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)合不同嫩度青磚茶生化結(jié)果及其與胃腸功能指標(biāo)的相關(guān)性分析，可以初步推測(cè)青磚茶的調(diào)理腸胃功能成分可能是游離氨基酸、茶多酚總量、咖啡堿、茶褐素［28］、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒(méi)食子酸［29］，還有微生物的參與并起到獨(dú)特作用。

適當(dāng)提高原料嫩度不僅不會(huì)影響青磚茶改善小鼠胃腸道的功能，而且能降低氟含量。