基于原子力顯微鏡壓痕技術(shù)的大鼠小梁網(wǎng)組織彈性模量測(cè)定

王川 李林 劉志成

0 引言

青光眼是全球第一大不可修復(fù)的致盲眼病，患病率已超過人口總量的3.5%。到2040年，全球患者總數(shù)將達(dá)到1.1億，是全球關(guān)注的重大健康問題之一[1]。眼球是密閉的腔體，眼內(nèi)房水異常堆積將導(dǎo)致眼壓升高[2-3]。小梁網(wǎng)房水排出通道是房水外流的主通道，約80%以上的房水經(jīng)小梁網(wǎng)通道排出[4]。小梁網(wǎng)的組織力學(xué)特性與小梁網(wǎng)的組織結(jié)構(gòu)以及房水流出阻力密切相關(guān)[5-6]。因此小梁網(wǎng)組織(trabecular meshwork,TM)力學(xué)特性的認(rèn)識(shí)對(duì)了解高眼壓狀態(tài)下房水流出阻力增加具有重要意義[7-8]。

小梁網(wǎng)組織內(nèi)嵌于前房角處的鞏膜區(qū)域，小梁網(wǎng)組織位置特殊，幾何尺寸小且組織分離難度大。對(duì)于小梁網(wǎng)組織目前尚無成熟的生物力學(xué)測(cè)試方法。在已有的大、小鼠小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性研究中，直接測(cè)量小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性主要用到2種方法，即單軸拉伸實(shí)驗(yàn)(uniaxial tensile test)與原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)壓痕實(shí)驗(yàn)[9-10]。前者需要?jiǎng)冸x小梁網(wǎng)組織，實(shí)驗(yàn)難度大且破壞了其原生理狀態(tài)，獲取的是垂直于房水流出方向的組織力學(xué)特性[11]。相比較而言，AFM壓痕實(shí)驗(yàn)更接近小梁網(wǎng)組織的生理狀態(tài)且獲取的是沿房水流出方向的組織力學(xué)特性。然而，由于鞏膜組織的非透光性導(dǎo)致其在光學(xué)顯微鏡下成像效果極差，極難分辨確切的小梁網(wǎng)組織部位，而AFM壓痕實(shí)驗(yàn)裝置需要搭載光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織部位的確定，導(dǎo)致了AFM壓痕實(shí)驗(yàn)無法準(zhǔn)確定位小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域的實(shí)際困難。目前，Huang等[10]采用Evans藍(lán)染料進(jìn)行前房灌注用于標(biāo)記大鼠小梁網(wǎng)組織，結(jié)合AFM壓痕實(shí)驗(yàn)獲取的大鼠小梁網(wǎng)組織彈性模量為162 Pa，該研究中Evans藍(lán)染料并不特定作用于小梁網(wǎng)，因此基于染色的方法確定小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域存在著不確定性。Wang等[5]采用眼球冷凍組織切片，將切片后的組織進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)獲取了小鼠小梁網(wǎng)組織的彈性模量為3 840 Pa，該研究中組織切片對(duì)小梁網(wǎng)組織的整體結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性均會(huì)產(chǎn)生一定的影響。這兩項(xiàng)研究均未給出大、小鼠小梁網(wǎng)組織在AFM測(cè)試環(huán)境下的位置、寬度信息以供后續(xù)研究做重要參考。

明確AFM測(cè)試環(huán)境下大鼠小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域并準(zhǔn)確定位，是獲取小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性的關(guān)鍵前提。探索基于原子力顯微鏡壓痕技術(shù)獲取大鼠小梁網(wǎng)組織彈性模量的方法，為揭示小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性與小梁網(wǎng)通道房水外流阻力之間的關(guān)系等研究奠定基礎(chǔ)。基于以上分析，本研究基于大鼠眼球組織切片呈現(xiàn)的小梁網(wǎng)組織與毗鄰組織之間的位置關(guān)系、距離信息和結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上，探索基于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)定位小梁網(wǎng)組織區(qū)域并獲取該組織彈性模量的測(cè)試方法，并利用該方法獲取了大鼠眼球鼻側(cè)、顳側(cè)、上側(cè)、下側(cè)4個(gè)位置處的小梁網(wǎng)組織彈性模量，也為即將進(jìn)行的小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性與小梁網(wǎng)通道房水外流阻力之間的關(guān)系等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的正常 8～10周雄性SD大鼠10只，無眼部疾病，眼壓正常，體質(zhì)量240～280 g。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，按體質(zhì)量1 mL/100g劑量給藥，深度麻醉后脫頸處死。眼科剪剪開結(jié)膜，剪斷視神經(jīng)，完整取出眼球，分別進(jìn)行標(biāo)號(hào)。分離了共20只眼球用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試。選取其中4只眼球區(qū)分左右眼用于組織學(xué)切片及染色處理，另外的16只眼球區(qū)分左右眼用于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，其中4只眼球用于確定AFM測(cè)試環(huán)境下小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域，另外12只眼球區(qū)分左右眼用于小梁網(wǎng)組織環(huán)周力學(xué)特性測(cè)試。所有實(shí)驗(yàn)和流程符合首都醫(yī)科大學(xué)使用動(dòng)物的聲明。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程及數(shù)據(jù)處理

1.2.1 組織切片染色

小梁網(wǎng)組織內(nèi)嵌于角鞏膜緣部位的鞏膜區(qū)域。考慮到前房角處角膜組織富含膠原纖維，小梁網(wǎng)組織富含肌纖維，這兩種組織經(jīng)過Masson染色后可以清晰地呈現(xiàn)出藍(lán)色和紅色的分布。因此，為了獲取小梁網(wǎng)組織與毗鄰組織之間的位置關(guān)系、距離信息和結(jié)構(gòu)信息，實(shí)驗(yàn)采用石蠟切片，Masson染色處理。垂直于虹膜縱向刨開眼球，切片厚度3 μm，每個(gè)眼球切片數(shù)量約30片，使用Zeiss(Axio Lab A,德國)顯微鏡進(jìn)行組織切片觀察并給出大鼠小梁網(wǎng)組織與毗鄰組織之間的距離信息和結(jié)構(gòu)信息，為AFM壓痕實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。

1.2.2 AFM力學(xué)測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)利用NT-MDT公司生產(chǎn)的NTEGRA原子力顯微鏡，懸臂梁的彈簧系數(shù)k=0.04 N/m，球形壓頭的材質(zhì)為氮化硅材料，壓頭半徑17 μm。AFM測(cè)試軟件為NovaPx軟件(NT-MDT，莫斯科，俄羅斯，version 3.2.5)。

實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)加載/調(diào)零。將大鼠眼球沿垂直于角膜方向剖開，去除眼球內(nèi)容物。在操作顯微鏡下利用鑷子將虹膜撕下。沿角膜、鞏膜方向裁條。AFM壓痕實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，將試樣自然平鋪在直徑為30 mm培養(yǎng)皿中。如圖1(a)所示，用3M膠帶分別將角膜和鞏膜部位與培養(yǎng)皿基底粘在一起，樣品制備過程中應(yīng)避免樣品的擠壓與拉伸。加入適量PBS緩沖液沒過樣品組織，置于倒置顯微鏡上方，進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)如圖1(b)所示。實(shí)驗(yàn)過程中，在靠近角鞏膜緣的角膜部位，實(shí)驗(yàn)中選了5個(gè)間隔20 μm的點(diǎn)分別進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，獲取了角膜的力-位移曲線，直至探針位置移動(dòng)到角鞏膜緣的上方，這個(gè)位置在光學(xué)顯微鏡下可以分辨。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用逐點(diǎn)(間隔20 μm)測(cè)量的方法，探針逐漸移動(dòng)到小梁網(wǎng)區(qū)域，從力-位移曲線的斜率可以看出這一變化。此處力-位移曲線將變得平緩(相對(duì)于角膜部位組織的力-位移曲線)，此時(shí)可以縮小測(cè)量的間距(間隔10 μm)，每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。直至測(cè)量進(jìn)入鞏膜區(qū)域，獲取鞏膜區(qū)域的力-位移曲線。

圖1 基于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)制備的大鼠角膜、小梁網(wǎng)、鞏膜組織樣品Figure 1 The cornea，TM and sclera of rats were prepared based on AFM indentation test

1.2.3 力-位移曲線的擬合方法

本實(shí)驗(yàn)采用球形針尖，針尖曲率半徑為17 μm，壓入深度為2 μm，對(duì)于大鼠小梁網(wǎng)組織，滿足附于剛性基底的半無限Hertz模型[12-13]：

式中：F/nN為針尖對(duì)樣品施加的作用力；R/nm為球形針尖的半徑；E/GPa為材料的彈性模量；v為材料泊松比，對(duì)于不可壓縮的生物組織泊松比取0.5；δ/nm為壓入深度。

坐標(biāo)(a,b)為力-位移曲線中探針與樣品的接觸點(diǎn)。將實(shí)驗(yàn)獲取的力-位移曲線進(jìn)行Hertz公式擬合[14]，給出彈性模量的信息，擬合過程及數(shù)據(jù)結(jié)果如圖2所示，整條曲線為實(shí)驗(yàn)獲取的力-位移曲線，紅色曲線為Hertz擬合曲線，δ表示壓入深度。

圖2 力-位移曲線及Hertz公式擬合Figure 2 Force-displacement curve and Hertz formula fitting

2 結(jié)果

2.1 組織切片的位置確定

Masson染色結(jié)果如圖3所示。Masson染色在眼組織主要有藍(lán)色、紅色、紫色分布，組織層次清晰可見，角膜組織膠原纖維為藍(lán)色，肌纖維為紅色。切片中可以分辨角膜后彈力層止端和鞏膜突位置，這2處位置中間為鞏膜內(nèi)溝，參考人眼組織結(jié)構(gòu)可以判斷這2處位置之間為小梁網(wǎng)組織區(qū)域。根據(jù)圖中標(biāo)尺可以確定此處距離角鞏膜緣約200 μm，小梁網(wǎng)組織的寬度約80 μm。在這些位置信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同組織的AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，并為AFM壓痕實(shí)驗(yàn)環(huán)境下定位小梁網(wǎng)組織區(qū)域提供參考。

圖3 大鼠眼部組織Masson染色Figure 3 Masson staining of rat eye tissue

2.2 不同組織彈性模量變化

根據(jù)1.2.3節(jié)給出的力-位移曲線擬合方法確定組織彈性模量，以1號(hào)右眼眼球?yàn)槔?，沿角?角鞏膜緣-小梁網(wǎng)-鞏膜方向的彈性模量的變化趨勢(shì)與組織間相對(duì)位置的關(guān)系如圖4所示。由于小梁網(wǎng)組織彈性模量遠(yuǎn)低于角膜及鞏膜組織，大鼠小梁網(wǎng)區(qū)域組織的彈性模量約為幾百Pa，因此AFM壓痕實(shí)驗(yàn)確定的小梁網(wǎng)組織的寬度約80 μm。對(duì)比眼球組織切片所獲取的小梁網(wǎng)組織寬度信息，AFM壓痕實(shí)驗(yàn)所獲取的小梁網(wǎng)組織寬度信息與組織切片觀察的結(jié)果具有一致性。

圖4 AFM壓痕實(shí)驗(yàn)獲取的角膜到鞏膜區(qū)域的彈性模量Figure 4 The elastic modulus of cornea to sclera region obtained from AFM indentation

2.3 AFM力學(xué)測(cè)試環(huán)境下小梁網(wǎng)區(qū)域位置的確定

AFM壓痕實(shí)驗(yàn)過程中記錄出現(xiàn)小梁網(wǎng)處組織彈性模量變小時(shí)，探針?biāo)幍奈恢脼榫嚯x角鞏膜緣處約200 μm。角鞏膜緣在鏡下比較容易辨認(rèn)。如圖5所示，上方第一條黑色水平直線即角鞏膜緣的位置，該直線下方的平行線所示位置為小梁網(wǎng)區(qū)域的上邊界。圖中兩條黑線中間的位置為角鞏膜緣至小梁網(wǎng)組織的過渡區(qū)域。參考懸臂梁的高度(200 μm)可以確定過渡區(qū)域?qū)挾却蠹s200 μm。此結(jié)果可為在AFM測(cè)試環(huán)境下快速定位小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域提供依據(jù)。即沿著角膜-鞏膜的方向進(jìn)行AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，當(dāng)控制懸臂梁的底端與角鞏膜緣平齊時(shí)，結(jié)合懸臂梁的高度約200 μm，懸臂梁頂端針尖所對(duì)應(yīng)的位置即是小梁網(wǎng)的開始測(cè)量點(diǎn)，以此位置開始約80 μm的跨角膜-鞏膜區(qū)域是小梁網(wǎng)組織的測(cè)試區(qū)域。

圖5 AFM壓痕實(shí)驗(yàn)中大鼠小梁網(wǎng)部位的確定(×50)Figure 5 Determination of TM position in AFM indentation experiment(×50)

2.4 小梁網(wǎng)組織環(huán)周彈性模量結(jié)果

考慮到小梁網(wǎng)組織沿房角處的環(huán)向分布特點(diǎn)，小梁網(wǎng)組織的彈性模量在不同的部位(如鼻側(cè)和顳側(cè))可能會(huì)有改變，因此，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了每只眼球取4個(gè)部位進(jìn)行力學(xué)測(cè)試，即鼻側(cè)、顳側(cè)、上側(cè)和下側(cè)4個(gè)互相對(duì)稱的位置。其中鼻側(cè)和顳側(cè)在取眼球之前用記號(hào)筆標(biāo)記，垂直與鼻側(cè)和顳側(cè)連線方向就是上側(cè)和下側(cè)小梁網(wǎng)位置。實(shí)驗(yàn)中將12只大鼠眼球按照沿著鼻、顳、上、下4個(gè)部位進(jìn)行裁樣。裁樣環(huán)節(jié)由于操作不熟練，導(dǎo)致2只眼球無法用于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，最終有10只眼球進(jìn)行了AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，每只眼球測(cè)試部位為上、下、鼻、顳4個(gè)部位。結(jié)合AFM力學(xué)測(cè)試環(huán)境下小梁網(wǎng)區(qū)域位置的確定方法，對(duì)小梁網(wǎng)區(qū)域進(jìn)行了AFM壓痕實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中每處組織間隔測(cè)試5個(gè)點(diǎn)，間距為10 μm。將實(shí)驗(yàn)獲取的力-位移曲線進(jìn)行Hertz擬合給出彈性模量的數(shù)值。區(qū)分左右眼將10只眼球的鼻側(cè)、顳側(cè)、上側(cè)、下側(cè)4個(gè)部位的彈性模量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式列于表1。

表1 大鼠眼部鼻側(cè)、顳側(cè)、上側(cè)、下側(cè)的小梁網(wǎng)組織彈性模量(n=5)Table 1 Values of elastic modulus of TM in nasal，temporal，superior and inferior sides of rat eyes(n=5)

采用Dunnett’s 多組間檢驗(yàn)的方法，左右眼4個(gè)部位的小梁網(wǎng)組織彈性模量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該數(shù)據(jù)說明在小梁網(wǎng)組織的彈性模量在不同的部位沒有明顯改變，因而進(jìn)行大鼠小梁網(wǎng)組織彈性模量測(cè)量的過程中，可以忽略小梁網(wǎng)組織不同位置處彈性模量的差異。

3 討論與結(jié)論

本研究探索了一種基于AFM壓痕技術(shù)定位大鼠小梁網(wǎng)組織并獲取該組織彈性模量的測(cè)試方法，基于該方法得到的大鼠小梁網(wǎng)彈性模量范圍為300～600 Pa。明確了大鼠小梁網(wǎng)組織測(cè)試區(qū)域?qū)挾燃s80 μm。小梁網(wǎng)區(qū)域彈性模量結(jié)果與Huang等[10]報(bào)道的結(jié)果相近。Huang等利用前房灌注染料進(jìn)行小梁網(wǎng)處組織的染色，然后利用AFM壓痕實(shí)驗(yàn)對(duì)染色處的組織進(jìn)行力學(xué)測(cè)試獲取的結(jié)果為162 Pa。該研究未考慮染料分子進(jìn)入小梁網(wǎng)通路之后對(duì)組織力學(xué)特性所產(chǎn)生的影響，同時(shí)，該染料并不能特定地對(duì)小梁網(wǎng)組織進(jìn)行染色，這使得在力學(xué)測(cè)試環(huán)節(jié)并不能準(zhǔn)確定位小梁網(wǎng)組織。Wang等[5]報(bào)道了一種基于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)對(duì)CBA/J與C57BL/6J兩種小鼠小梁網(wǎng)組織彈性模量的測(cè)量方法，所得結(jié)果分別為3.84 kPa±3.37 kPa(n=7)和3.22 kPa±1.84 kPa(n=3)。所得彈性模量值要大于本研究的結(jié)果，他們提出了對(duì)小梁網(wǎng)測(cè)試部位具有一定的不確定性。

本研究同樣存在著局限性。首先，AFM測(cè)試環(huán)境下角鞏膜緣部位的確定存在著主觀性，需要進(jìn)一步優(yōu)化測(cè)試方法。其次，所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差較大，應(yīng)進(jìn)一步縮小測(cè)試的步長(zhǎng)，進(jìn)一步優(yōu)化測(cè)試過程，這樣獲得的結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。第三，對(duì)于小梁網(wǎng)組織不同部位的彈性模量結(jié)果，由于動(dòng)物的個(gè)體差異及不同樣本間的結(jié)果存在差異，后續(xù)研究中可以通過加大樣本量，得到更加一致的結(jié)果。

基于AFM壓痕實(shí)驗(yàn)獲取小梁網(wǎng)組織力學(xué)特性，其測(cè)試結(jié)果受到AFM針尖幾何形狀、針尖尺寸、檢測(cè)條件的設(shè)定、數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用等因素的影響。在每次測(cè)量的過程中，可以保證測(cè)試時(shí)的溫度、濕度保持相對(duì)穩(wěn)定。因此誤差的來源可歸屬于系統(tǒng)誤差。系統(tǒng)誤差對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響是一致的。因此，同批次的小梁網(wǎng)組織的測(cè)量結(jié)果之間具有可比性。本研究獲取的小梁網(wǎng)組織彈性模量值標(biāo)準(zhǔn)差較大，原因主要由小梁網(wǎng)組織結(jié)構(gòu)分布的非均勻性所導(dǎo)致的，小梁網(wǎng)是由相互聯(lián)結(jié)的小梁組成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織[15]，壓痕實(shí)驗(yàn)中采集的5個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，有的可能壓在小梁網(wǎng)組織孔洞較多的部位(結(jié)果偏小)，有的可能會(huì)壓在彈性纖維上(結(jié)果偏大)，因此，取平均之后，標(biāo)準(zhǔn)差會(huì)比較大。小梁網(wǎng)組織彈性模量與小梁網(wǎng)組織的細(xì)觀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，需要進(jìn)一步研究小梁網(wǎng)組織彈性模量的結(jié)構(gòu)依賴性。

本研究基于大鼠眼球組織切片呈現(xiàn)的大鼠小梁網(wǎng)組織與毗鄰組織之間的位置關(guān)系，給出了一種基于AFM壓痕技術(shù)獲取大鼠小梁網(wǎng)彈性模量的測(cè)試方法。該方法提供了AFM測(cè)試環(huán)境下小梁網(wǎng)組織區(qū)域的位置參考，優(yōu)勢(shì)在于可快速定位到大鼠小梁網(wǎng)組織區(qū)域。