外周血樹突狀細(xì)胞Tim-3蛋白、CD80、CD86表達(dá)與骨髓增生異常綜合征預(yù)后的相關(guān)性

余娟，嚴(yán)曉琴，鄒夏，華芳

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一種或多種血細(xì)胞類型發(fā)育不良，以及骨髓譜系中細(xì)胞減少和功能異常的疾病[1]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)可提供淋巴細(xì)胞活化、增殖的信號，在自身免疫監(jiān)控、體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)是一種由淋巴細(xì)胞亞型輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1，Th1)、Th17、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞及髓系細(xì)胞表達(dá)的Ⅰ型跨膜蛋白[3]?，F(xiàn)檢測MDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞Tim-3、CD80、CD86表達(dá)水平，分析其與MDS患者預(yù)后的相關(guān)性，以期為臨床防治MDS提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年11月—2017年11月于四川大學(xué)華西醫(yī)院血液內(nèi)科就診的MDS患者104例作為研究對象(觀察組)，男59例，女45例，年齡53～76(61.17±7.35)歲；病程2.15～8.01(5.32±2.64)年；合并癥：糖尿病22例，慢性心力衰竭15例，肺炎19例；有家族遺傳病史32例，既往均無治療史。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織公布的MDS分型標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分型：難治性貧血患者9例，難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多患者13例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多Ⅰ型患者43例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多Ⅱ型患者32例，5q-綜合征7例。根據(jù)MDS國際預(yù)后評分系統(tǒng)(international prognostic scoring system，IPSS)[5]對104例患者進(jìn)行預(yù)后分組，低危亞組(0分0.05)；與健康對照組比較，觀察組環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例、骨髓涂片原始細(xì)胞升高，Hb、PLT、RBC水平降低(P<0.01)，見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號：2015-07-257B)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組受試者臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合“骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國專家共識(2014年版)”診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；② MDS患者持續(xù)4個(gè)月一系或多系血細(xì)胞減少(Hb<110 g/L，中性粒細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)<1.5×109/L)；③臨床資料完整者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他可導(dǎo)致血細(xì)胞減少和發(fā)育異常的造血及非造血系統(tǒng)疾病；②伴隨嚴(yán)重肝腎功能不全或衰竭；③患有自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)；④患有骨轉(zhuǎn)移癌、肝癌、肺癌等腫瘤疾病等患者。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 外周血DC細(xì)胞培養(yǎng)：采集受試者肘靜脈血15 ml并抗凝，緩慢加入預(yù)先加有人淋巴細(xì)胞分離液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)5 ml的離心管中，室溫下離心，吸取中間層白色細(xì)胞至15 ml離心管，加入含20%胎牛血清(FBS，武漢普諾賽生命科技有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)5 ml，混勻，離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)2 ml混勻1～2 min，離心棄上清；加入含10% FBS血清的RPMI-1640重懸計(jì)數(shù)鋪板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，細(xì)胞貼壁后棄去非貼壁細(xì)胞，加入含有重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF，上海江萊生物科技有限公司)20 μg/L和重組人白介素-4(rhIL-4，上海江萊生物科技有限公司)完全培養(yǎng)基20 μg/L培養(yǎng)，隔天半量換液，培養(yǎng)至第7 d。用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長、形態(tài)及數(shù)量變化情況，并拍照。當(dāng)看到細(xì)胞體積明顯變大，約為單個(gè)核細(xì)胞的三四倍，大部分細(xì)胞發(fā)生脫壁、懸浮，可見伸展的毛刺狀突起，為典型的DC細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞CD80、CD86含量:使用0.5%乙二胺四乙酸消化DC細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入流式細(xì)胞緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，加入PE標(biāo)記抗人-CD11c/CD80抗體(英國Abcam公司)2.5 μl，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗人-MHC-Ⅱ/CD86抗體(英國Abcam公司)2 μl，冰上放置30 min，避光染色，中間混勻1次，加入染色緩存液1 ml，終止染色，離心收集細(xì)胞，加入PBS重懸細(xì)胞200 μl，過篩網(wǎng)后上流式細(xì)胞儀(上海然哲儀器設(shè)備有限公司，型號NovoCyt)檢測，用標(biāo)記的百分率表示其含量。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測Tim-3蛋白表達(dá)水平:收集培養(yǎng)的DC細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液500 μl，冰浴30 min，離心30 min后吸取上清至EP管。用BCA法(試劑盒購自美國賽默飛公司)測定全細(xì)胞裂解液蛋白濃度，每孔取40 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗(Tim-3、GAPDH，英國Abcam公司)均1∶1 000孵育4℃過夜，羊抗人二抗(英國Abcam公司)1∶10 000室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，以Quantlty One軟件分析其灰度值。

1.4 隨訪 通過門診復(fù)查或打電話的方式對患者進(jìn)行為期3年的隨訪，隨訪起始時(shí)間為收治患者入院之日，隨訪截止時(shí)間為患者死亡或到截止日期，記錄患者3年內(nèi)生存率。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞比例比較 觀察組外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞的平均比例為(71.56±9.14)%，顯著高于健康對照組的(44.13±7.46)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.461，P=0.000)，見圖1。

2.2 2組DC細(xì)胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86比例比較 與健康對照組比較，觀察組外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例均升高(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 2組受試者外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例比較

2.3 各亞組MDS患者DC細(xì)胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86比例比較 低危亞組、中危亞組、高危亞組DC細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例依次升高(P均<0.01)，見表3。

注：PBMC.外周血單個(gè)核細(xì)胞；DC.樹突狀細(xì)胞；Tim-3.T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3；GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶圖2 2組外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)印跡圖

表3 各亞組MDS患者外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例比較

2.4 DC細(xì)胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86分別與MDS患者骨髓指標(biāo)相關(guān)性分析 MDS患者DC細(xì)胞中Tim-3蛋白分別與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例、骨髓涂片原始細(xì)胞呈正相關(guān)(P<0.05)，與PLT、RBC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；CD80與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例、骨髓涂片原始細(xì)胞呈正相關(guān)(P<0.01)，與PLT呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；CD86與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.01)，見表4。

表4 DC細(xì)胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86分別與MDS患者骨髓指標(biāo)相關(guān)性分析

2.5 各亞組MDS患者生存率比較 MDS患者3年累積生存率比較，低危亞組(91.67%，44/48)高于中危亞組(70.97%，22/31)高于高危亞組(36.00%，9/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.360，P=0.000)，見圖3。

注：MDS.骨髓增生異常綜合征圖3 各亞組MDS患者生存率比較

2.6 影響MDS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示，Tim-3蛋白、CD80、CD86水平升高是MDS患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響MDS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

MDS作為一組克隆性造血干細(xì)胞疾病，其特征在于無效的造血功能導(dǎo)致血細(xì)胞減少，并具有發(fā)展為急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。當(dāng)干細(xì)胞受損導(dǎo)致子代血液細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜變化，包括細(xì)胞分化、增殖/成熟缺陷時(shí)，MDS就會(huì)啟動(dòng)[10]。在過去的幾十年中，對MDS的認(rèn)識和治療迅速發(fā)展，病理生物學(xué)的主要部分已被闡明，一些診斷和預(yù)后判斷的工具得到實(shí)施，新的治療方法被發(fā)現(xiàn)。但是MDS仍然是一種具有廣泛異質(zhì)性和不明確診斷的疾病，臨床對MDS的診斷確定性，患者是否有AML轉(zhuǎn)化或骨髓衰竭的危險(xiǎn)均不可知，因此，對MDS的發(fā)病機(jī)制及其預(yù)后影響因素進(jìn)行研究，可能有助于臨床醫(yī)生對MDS的防治。

流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析可以識別異常增加或減少的良性及惡性漿細(xì)胞數(shù)量，以及成熟或不成熟譜系標(biāo)記的異常表達(dá)，因此，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為MDS診斷、預(yù)后和檢測病程的重要工具[11]。DC細(xì)胞作為天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，在識別病原體和激活B、T淋巴細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。郭含夢等[12]發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，MDS患者白介素-17、白介素-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等多種細(xì)胞因子水平升高，猜測MDS患者可能存在DC細(xì)胞含量增加，并促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞的平均比例高于健康對照組，提示MDS患者外周血DC可能參與了MDS的病理變化。MDS患者的造血功能可通過改變抗原表達(dá)、細(xì)胞亞群頻率和散射特性而與正常人不同。免疫表型改變在MDS患者的診斷、危險(xiǎn)分層和治療指導(dǎo)方面已被證明有應(yīng)用價(jià)值[13]。Tim-3是TIM家族蛋白成員，編碼基因位于人類染色體帶5q33.2上，在分泌IFN-γ、CD8+T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞等的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)[14-15]。因此，Tim-3的治療靶向可能通過作用于多種細(xì)胞類型來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。王方方等[16]發(fā)現(xiàn)，MDS患者Tim-3表達(dá)水平可能參與MDS的發(fā)病，并可能成為臨床鑒別再生障礙性貧血與MDS的標(biāo)志物。CD80是CD86活化T淋巴細(xì)胞時(shí)的協(xié)同刺激因子，在自身免疫監(jiān)控、體液免疫應(yīng)答及移植反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17-18]。Tcvetkov等[19]在對55例MDS患者的3年隨訪中發(fā)現(xiàn)，CD80高表達(dá)患者中有72.9%的患者疾病發(fā)生了惡化，而CD80低表達(dá)患者有52.1%發(fā)生了惡化，差異顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，觀察組外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例均升高；與低危亞組比較，中危亞組、高危亞組DC細(xì)胞Tim-3蛋白表達(dá)水平及CD80、CD86比例也依次升高，提示高表達(dá)的Tim-3、CD80、CD86可能與MDS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與姚丹丹等[20]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，MDS患者DC細(xì)胞中Tim-3蛋白分別與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例、骨髓涂片原始細(xì)胞呈正相關(guān)，與PLT、RBC呈負(fù)相關(guān)；而CD80與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例、骨髓涂片原始細(xì)胞呈正相關(guān)，與PLT呈負(fù)相關(guān)；CD86與環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞比例呈正相關(guān)，此結(jié)果說明Tim-3、CD80、CD86與MDS患者骨髓指標(biāo)均有一定的相關(guān)性，進(jìn)一步說明Tim-3、CD80、CD86可能是影響MDS發(fā)生發(fā)展的因素。本研究結(jié)果也顯示，低危亞組、中危亞組、高危亞組MDS患者3年累積生存率依次降低。提示IPSS評分越高生存率越低，可能與Tim-3、CD80、CD86的異常高表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步經(jīng)多因素Logistic回歸分析顯示，Tim-3蛋白、CD80、CD86水平升高是MDS患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示Tim-3、CD80、CD86異常表達(dá)與MDS的預(yù)后有關(guān)，猜測可能是Tim-3、CD80、CD86異常表達(dá)導(dǎo)致DC細(xì)胞免疫功能障礙，不能有效地遞呈抗原給T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，因而造成機(jī)體功能免疫紊亂，可能作為潛在的臨床治療靶標(biāo)。

綜上所述，MDS患者外周血PBMC誘導(dǎo)成熟DC細(xì)胞比例及DC細(xì)胞中Tim-3蛋白、CD80、CD86水平均升高，與MDS患者預(yù)后不良有關(guān)，可能作為潛在的防治靶標(biāo)。本研究未對MDS患者炎性反應(yīng)水平進(jìn)行檢測分析，下一步可以結(jié)合MDS患者炎性反應(yīng)水平探究Tim-3蛋白、CD80、CD86水平與MDS的相關(guān)性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

余娟：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；嚴(yán)曉琴：提出研究思路，課題設(shè)計(jì)，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；鄒夏：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；華芳：收集資料和修改論文，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析