miR-494和ATF3 mRNA在腦膜瘤組織中的表達(dá)關(guān)系及意義

王剛，張金仿，張茜，高琰，董益鵬，吳濤

腦膜瘤是臨床較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，部分腦膜瘤因生長部位特殊、侵襲性生長、緊鄰重要組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致手術(shù)不能全切腫瘤，對(duì)患者生存狀況造成不利影響[1]。目前，腦膜瘤發(fā)病相關(guān)機(jī)制尚不完全明確，但研究認(rèn)為其發(fā)病與基因變異、環(huán)境、顱腦外傷、炎性反應(yīng)、微小RNA(microRNA，miRNA)等有關(guān)[2-3]。miRNA可調(diào)控有關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，其在腦膜瘤中表達(dá)異常，miRNA可作為腦膜瘤非侵入性標(biāo)志物[4]。近期研究顯示，微小RNA-494(miRNA-494，miR-494)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)上調(diào)，其可能影響有關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤癌細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而促進(jìn)癌癥發(fā)展[5]。另有研究表明，激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)在腦膜瘤中呈高表達(dá)，ATF3信使RNA(mRNA)表達(dá)水平與病理分級(jí)呈正相關(guān)[6]。但miR-494、ATF3在腦膜瘤患者中的表達(dá)水平及其與腦膜瘤臨床特征的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道?；诖耍F(xiàn)檢測(cè)miR-494、ATF3 mRNA在腦膜瘤組織中的表達(dá)水平，分析兩者與腦膜瘤臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為早期診療腦膜瘤、評(píng)估患者預(yù)后提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年10月—2018年1月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)外科行腦膜瘤切除患者79例為腦膜瘤組，患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療及免疫治療。男33例，女46例，年齡44～69(57.74±9.46)歲，<60歲39例，≥60歲40例；腫瘤部位：顱底34例，非顱底45例；腫瘤直徑：<4 cm 38例，≥4cm 41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；WHO分級(jí)[7]：Ⅰ～Ⅱ級(jí)51例，Ⅲ級(jí)28例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期37例；有家族遺傳史者7例；基礎(chǔ)病：合并糖尿病/高血壓者12例。另取因腦外傷切除腦組織患者79例為對(duì)照組，男35例，女44例，年齡45～71(58.04±9.83)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：2013第241號(hào))，患者及家屬知情同意并簽署協(xié)議書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考“2016年世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類”關(guān)于腦膜瘤相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[7]。(2)納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合腦膜瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)確診；②患者生理病理檢查資料均完整；③既往無精神障礙史，可自由溝通和交流。(3)排除標(biāo)準(zhǔn)：①有心源性休克史者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并急性炎性反應(yīng)、血液系統(tǒng)疾病者；④合并心、肝、腎等功能不全者。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-494、ATF3 mRNA表達(dá) 將術(shù)中切除且經(jīng)病理學(xué)確診為腦膜瘤組織及對(duì)照組正常腦膜組織標(biāo)本均立即置于液氮罐中，凍存24 h后，移至-80 ℃冰箱中保存，待檢。上述腦膜瘤組織及正常腦膜組織，置于研缽中，加液氮、研碎，加TRIzol試劑(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)裂解、離心，提取RNA。參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix，上海浩然生物技術(shù)有限公司)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。嚴(yán)格按照PCR試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix，上海研卉生物科技有限公司)說明書，配制反應(yīng)體系、qPCR檢測(cè)。總反應(yīng)體系(20 μl)包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 8 μl，cDNA 2 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，dH2O 8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性45 s，95 ℃ 15 s，60℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。miR-494以U6為內(nèi)參，ATF3 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，以2-△△CT法計(jì)算miR-494、ATF3 mRNA的表達(dá)水平。檢測(cè)基因及內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 miR-494、ATF3 mRNA及對(duì)應(yīng)內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

1.4 隨訪 對(duì)79例腦膜瘤患者以門診或電話隨訪3年，以腦膜瘤患者手術(shù)日期為隨訪起點(diǎn)，患者死亡或隨訪至2021年1月31日為隨訪終點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 2組miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，腦膜瘤組miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 2組miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較 以腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平均值1.65、1.74為界限，≤1.65的患者為miR-494低表達(dá)亞組(n=38)，>1.65的患者為miR-494高表達(dá)亞組(n=41)，≤1.74的患者為ATF3 mRNA低表達(dá)亞組(n=40)，>1.74的患者為ATF3 mRNA高表達(dá)亞組(n=39)。結(jié)果顯示，腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA低表達(dá)亞組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者比例低于高表達(dá)亞組(P<0.05)，而在不同性別、年齡、部位、腫瘤直徑、有無家族遺傳史、有無基礎(chǔ)病患者中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平在腦膜瘤患者不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 腦膜瘤組織miR-494表達(dá)與ATF3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，腦膜瘤組織中miR-494表達(dá)水平與ATF3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.578，P=0.000)。

2.4 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平與腦膜瘤患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)79例腦膜瘤患者隨訪36個(gè)月，腦膜瘤患者死亡29例，存活50例，總生存率為63.29%。腦膜瘤患者miR-494低表達(dá)亞組術(shù)后36個(gè)月累積生存率為89.47%(34/38)，明顯高于miR-494高表達(dá)亞組累積生存率39.02%(16/41)(χ2=21.798，P=0.019)。腦膜瘤患者ATF3 mRNA低表達(dá)亞組術(shù)后36個(gè)月累積生存率為82.50%(33/40)，明顯高于ATF3 mRNA高表達(dá)亞組累積生存率43.59%(17/39)(χ2=13.015，P=0.000)。

2.5 COX回歸分析腦膜瘤患者預(yù)后的影響因素 以腦膜瘤患者預(yù)后為因變量，以上述結(jié)果中P<0.05的指標(biāo)為自變量，納入二分類COX回歸模型，結(jié)果顯示，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平升高是影響腦膜瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見表4。

表4 COX回歸分析腦膜瘤患者預(yù)后的影響因素

3 討 論

惡性腦膜瘤具有高度侵襲性、彌漫性的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者生命健康[9-10]。此外，臨床多采用手術(shù)切除、放射治療等手段治療腦膜瘤，但預(yù)后較差[11-12]，基因靶向治療雖有望作為臨床治療腦膜瘤的有效手段，但目前仍缺少理想治療靶標(biāo)，因此，尋找影響腦膜瘤的指標(biāo)，明確其在腦膜瘤中的發(fā)病機(jī)制，對(duì)改善患者生存質(zhì)量有一定積極意義。

miRNA是廣泛存在于血液及各大器官組織的小分子RNA，其在免疫調(diào)節(jié)、機(jī)體代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等過程中具有重要調(diào)控作用[13-15]。miR-494是miRNA家族成員之一，與缺血缺氧疾病及腫瘤發(fā)展有關(guān)，其在非小細(xì)胞肺癌患者血清中水平明顯上調(diào)，miR-494是影響術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，其對(duì)判斷患者預(yù)后有一定潛在價(jià)值[16]。另有研究顯示，miR-494在乳腺癌患者中表達(dá)失調(diào)，其可通過抑制煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活力[17]。本研究中腦膜瘤組miR-494表達(dá)水平較對(duì)照組高，與其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的趨勢(shì)一致[5]，提示miR-494可能在腦膜瘤發(fā)病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，推測(cè)miR-494可能作為促癌因子，通過與靶基因相結(jié)合，影響相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞凋亡，從而參與并促進(jìn)腦膜瘤發(fā)展，但具體作用機(jī)制如何，需要進(jìn)一步研究。

ATF3屬于ATF/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)亞家族成員，是細(xì)胞在神經(jīng)元或肝損傷、缺血—再灌注損傷、皮膚損傷、DNA損傷或病毒癌基因刺激下產(chǎn)生的一種含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在基因轉(zhuǎn)錄、創(chuàng)傷愈合、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、腫瘤形成、侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程中起重要作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，ATF3在腎上腺皮質(zhì)腺腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)升高，下調(diào)ATF3表達(dá)可抑制腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞增殖，激活細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[20]。另外，ATF3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中呈過表達(dá)，ATF3-siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U373MG細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡比例增加，細(xì)胞遷移受到損害，提示ATF3促進(jìn)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展[21]。本研究中腦膜瘤組ATF3 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組高，與馬斯奇等[6]研究結(jié)果相符，提示ATF3 mRNA可能與腦膜瘤發(fā)病進(jìn)程相關(guān)，究其原因，ATF3 mRNA作為應(yīng)激早期快速反應(yīng)基因，經(jīng)損傷性應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)后表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而在腫瘤形成與發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。

本研究中腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WHO分級(jí)、TNM分期有關(guān)，進(jìn)一步提示兩者可能影響腦膜瘤臨床特征，參與腦膜瘤發(fā)展進(jìn)程，推測(cè)miR-494、ATF3 mRNA均可能增強(qiáng)癌細(xì)胞的浸潤、侵襲，促進(jìn)腦膜瘤轉(zhuǎn)移。本研究顯示，腦膜瘤組織miR-494表達(dá)水平與ATF3 mRNA水平呈正相關(guān)，提示miR-494可能與ATF3 mRNA相互影響，協(xié)同促進(jìn)腦膜瘤發(fā)展，推測(cè)miR-494、ATF3 mRNA共同調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡，但具體調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)，腦膜瘤患者miR-494、ATF3 mRNA低表達(dá)亞組術(shù)后36個(gè)月累積生存率分別高于miR-494、ATF3 mRNA高表達(dá)亞組，提示腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)升高與不良預(yù)后有關(guān)，二者有望作為評(píng)估腦膜瘤患者預(yù)后的標(biāo)志物。此外，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)水平升高是影響腦膜瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)miR-494、ATF3 mRNA水平有利于判斷患者預(yù)后情況。

綜上所述，腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達(dá)均上調(diào)，兩者可能通過相互作用共同參與腦膜瘤發(fā)展，檢測(cè)兩者水平有助于評(píng)估患者預(yù)后。但未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面探究miR-494、ATF3 mRNA在腦膜瘤中的作用機(jī)制，后續(xù)將深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王剛：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文撰寫；張金仿、張茜：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；高琰：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；董益鵬、吳濤：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析