BSA-Gd2O3-HSP90靶向型納米探針標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞及瘤體磁共振成像處理

林李芃，閆翔宇，袁崢鼎，戴家杰，濮芷青，徐凱，王永?

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇 徐州；2.徐州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州；3.徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 徐州；4.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)影像科，江蘇 徐州）

0 引言

近年來，口腔鱗癌（Oral Squamous Cell Carcinomas,OSCC）的發(fā)病率不斷增加，因其易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等疾患問題，預(yù)后相對(duì)較差。因此控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移路徑對(duì)該腫瘤的治療和預(yù)后都起著重要作用。隨著各類成像技術(shù)的發(fā)展，在衍生出的一系列非侵襲性檢測(cè)手段中，分子影像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)更有助于明確目標(biāo)腫瘤的轉(zhuǎn)移路徑和部位，從而清晰掌握口腔鱗癌動(dòng)態(tài)治療手段[1]。熱休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP）是一種能在體內(nèi)特異性高表達(dá)的蛋白，主要在細(xì)胞分化及基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮主要作用，又名“伴侶蛋白”。而其中熱休克蛋白90（Heat Shock Protein 90,HSP90）又與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后最具相關(guān)性，HSP90能較松弛地結(jié)合在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜表面，靶向性指引腫瘤細(xì)胞遷移軌跡[2-3]。而在口腔細(xì)胞中，HSP90與口腔鱗癌細(xì)胞的分化增殖相關(guān)，可在其中高度特異性表達(dá)。在前期研究中我們可以證明BSA-Gd2O3能夠作為可靠的磁共振成像（MRI）納米探針載體，基于BSA-Gd2O3能夠制備出可有效地標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的靶向型納米探針[4]。

本實(shí)驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用BSA-Gd2O3對(duì)比劑與鼠抗人HSP90結(jié)合形成的納米探針靶向示蹤體外口腔鱗癌細(xì)胞，根據(jù)原始圖像及Matlab7.0系統(tǒng)處理后圖像成像效果對(duì)其示蹤機(jī)制進(jìn)行探討，為以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的影像提取實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器及設(shè)備

主要包括：B13-3型磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司），HERACELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱（上海寶賽生物科技有限公司），L400臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電熱恒溫水溫箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠），電子天平BSM120.4（上海市卓精電子科技有限公司），3.0T全身磁共振成像設(shè)備（GE Discovery 750w，美國(guó)GE公司）等。

1.1.2 試劑

主要包括：新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），六水硝酸釓（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），PBS緩沖液粉末pH7.3（北京中山金橋生物科技有限公司），口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞（上海中喬新舟生物科技有限公司），MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海中喬新舟生物科技有限公司），青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），無血清凍存液（徐州微科曼得生物工程有限公司），HSP90抗體（鼠抗人熱休克蛋白90，北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），磷酸二氫鈉（南京化學(xué)試劑有限公司）等。

1.1.3 耗材

主要包括：10 mL及50 mL離心管（美國(guó)Corning公司），3500Da透析袋美國(guó)SpectrumLabs公司，六孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司），巴氏管（美國(guó)Corning公司）培養(yǎng)瓶，EP管（美國(guó)AXYGEN公司），移液器槍頭（美國(guó)AXYGEN公司）等。

1.2 制備BSA-Gd2O3磁共振納米探針

按我們前期實(shí)驗(yàn)的方法[5]，稱取BSA（牛血清蛋白）250 mg溶解于9 mL水中，緩慢加入1 mL 50 mol/L的六水硝酸釓后劇烈攪拌，5 min后加入1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉后劇烈攪拌，混合后置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱，同時(shí)在底部加入直徑1 cm的磁珠后將其置于磁力攪拌器上以1200 r/min的速度劇烈攪拌12 h。充分反應(yīng)后，將溶液倒入3500Da的透析袋中，將透析袋包被完整置于磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速500 r/min攪拌30 h，分別間隔3 h、5 h、16 h后換水。透析后溶液體積由10 mL稀釋為20 mL，從中取8 mL離心后取上清液分散于3.2 mL 20 mol/L的PBS（pH=7.4）緩沖液中，得到非均一的絮狀乳白色沉淀。制備及儲(chǔ)存過程中避光。將制備好的BSA-Gd2O3對(duì)比劑用3.0T磁共振掃描儀檢測(cè)信號(hào)正常后置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 Cal-27口腔鱗癌貼壁細(xì)胞模型建立

將復(fù)蘇后的口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞置于含10%胎牛血清的EME培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度95%的條件下培養(yǎng)1周。待細(xì)胞貼壁密度達(dá)到80%后用0.25%胰蛋白酶消化，每3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.4 Cal-27細(xì)胞的體外對(duì)比劑靶向結(jié)合

將1 mg EDC、鼠抗人HSP90抗體與300 μL PBS緩沖液混合，37 ℃水浴加熱15 min后加入1 mg NHS及500 μL傳代后的口腔鱗癌Cal-27細(xì)胞并混合均勻，37 ℃水浴2 h后接種到6孔接種板上，設(shè)置孔板階梯濃度分別為：0（空白對(duì)照組），10%，30%，50%，70%，100%，每孔加入 PBS緩沖溶液定容至500 μL，待充分混合1 h后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，保存在濃度為35%的甲醛溶液中，檢測(cè)口腔鱗癌細(xì)胞與HSP90抗體結(jié)合情況。

1.5 Cal-27瘤體MR成像及圖像分析

將上述細(xì)胞懸液注入目標(biāo)裸鼠體內(nèi)后培養(yǎng)成瘤，置于3.0T全身磁共振成像設(shè)備下獲取瘤體原始圖像。應(yīng)用Matlab7.0系統(tǒng)處理圖像：首先讀取原始MRI圖像，對(duì)圖像進(jìn)行判斷：如果為三通道的RGB圖像，先進(jìn)行圖像灰度化。接著進(jìn)行灰度反轉(zhuǎn)、陰影濾波、平滑濾波、邊緣增強(qiáng)、輪廓濾波。最后生成植入Cal-27細(xì)胞后的裸鼠MRI的T1橫斷面圖像處理結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 圖像處理效果比較

見圖1、圖2。

圖1 未經(jīng)處理的MRI T1橫斷面原始圖像

圖2 處理后的T1橫斷面（圖像從左至右從上至下依次是原圖像、灰度反轉(zhuǎn)、陰影濾過、平滑濾波、邊緣增強(qiáng)、輪廓濾波）

2.2 部分代碼及說明

% 中值濾波來做圖像平滑，濾波模板為3*3

I_medfilt = medfilt2(I_src,[3 3]);

subplot(2,3,4);

imshow(I_medfilt);

title('平滑濾波');

% canny邊緣檢測(cè)算子來進(jìn)行邊緣檢測(cè)

I_canny=I_src;

BW1=edge(I_canny,'canny');

I_canny=double(I_canny);

g=[0-0.40;-17-1;0-0.40]/5;

m=filter2(g,I_canny);

k=0.9;

I_enhance = I_canny+k*m+double(BW1);

subplot(2,3,5);

imshow(uint8(I_enhance));

title('邊緣增強(qiáng)');

BW2=edge(I_canny,'sobel');

[I_x,I_y]=gradient(double(I_canny));

I_gradient =I_x.*I_x+I_y.*I_y;

I_gradient =I_gradient+I_canny;

subplot(2,3,6);

imshow(I_gradient,[]);

title('輪廓濾波');

2.3 口腔鱗癌細(xì)胞的靶向磁共振信號(hào)表征

分別配制成釓離子濃度為 0、0.05、0.1、0.3、0.7、1 mmol/L的溶液，用3.0T Discovery 750w MRI測(cè)量不同濃度的T1弛豫時(shí)間，計(jì)算T1弛豫率。

掃描參數(shù)為：① 冠狀位T1WI：TE=Out of phase，TR=16.0 ms，矩陣 =288×288，F(xiàn)OV=18 cm×18 cm，層厚 =1.0 mm。②軸位 T1WI：TE=Out of phase，TR=21.1 ms，矩陣=256×256，F(xiàn)OV=6 cm×6 cm，層厚=1.0 mm。

3 討論

大量的探索和研究已經(jīng)為磁共振示蹤口腔鱗癌的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，在臨床治療層面上，在體水平上圖像示蹤靶點(diǎn)的位置改變預(yù)示著臨床應(yīng)用上口腔鱗癌的不同分期，術(shù)中組織學(xué)和圖像引導(dǎo)手術(shù)等發(fā)展目標(biāo)是在手術(shù)過程中更準(zhǔn)確地描繪腫瘤的邊界，使腫瘤切除更加準(zhǔn)確[6]。磁共振（MRI）已經(jīng)成為腫瘤早期篩查及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭踩肽[瘤示蹤的利器，利用Matlab7.0對(duì)圖像進(jìn)行平滑濾波、邊緣增強(qiáng)、輪廓濾波等操作，為磁共振圖像提供更加直觀的方位閱覽。圖中對(duì)比結(jié)果顯示口腔鱗癌腫瘤的MRI處理圖像明顯好于原始圖像，處理界面清晰，且腫瘤信號(hào)在靶向?qū)Ρ葎┑囊龑?dǎo)下表達(dá)更為強(qiáng)烈，為臨床診斷口腔鱗癌起到輔助作用。因此，如何更好地將納米探針對(duì)比劑運(yùn)用于體外目標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)以及使用輔助性圖像系統(tǒng)處理目標(biāo)磁共振圖像都是日后口腔鱗癌分子影像技術(shù)靶向示蹤的重要研究方向。