黃精根際及藥用部位內(nèi)生真菌群落組成和生態(tài)功能分析

樊銳鋒 王若凡 杜艷秋 劉艷 黃慶陽

摘 要： 為尋找促進藥用植物活性代謝產(chǎn)物合成的微生物，該文以黃精為研究對象，利用高通量測序技術(shù)和生態(tài)功能預測平臺，測定根際土真菌、根莖和根內(nèi)生真菌的ITS序列，分析其真菌多樣性和群落組成，并預測根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能。結(jié)果表明：（1）測序得到1 023個可操作分類單元（OTUs），根際、根莖和根真菌OTU數(shù)分別為703、128和141，三種部位真菌群落組成差異顯著，根際土存在特有的真菌類群，即壺菌門。（2）根際土、根莖及根共有OTU 41個，子囊菌門占共有真菌的58.15%，豐度最大。（3）根莖內(nèi)生真菌被劃分6個生態(tài)功能群，包括未定義腐生菌、菌寄生真菌、動物病原菌、植物病原菌、叢枝菌根真菌和地衣共生真菌，37個undefined種類（34.91%）在FUNGuild數(shù)據(jù)庫中沒有參考信息。研究認為根莖中優(yōu)勢菌屬Setophoma、新赤殼屬等內(nèi)生真菌可能與活性代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，可為黃精藥用功能菌群的發(fā)掘提供數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞： 黃精， 內(nèi)生真菌， 根莖， 群落組成， FUNGuild

中圖分類號： Q948.12

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2021）05-0799-09

Community composition and ecological function of rhizosphere fungi and medicinal parts endophytic fungi in Polygonatum sibiricum

FANG Ruifeng1，2， WANG Ruofan1， DU Yanqiu1， LIU Yan1， HUANG Qingyang3*

（ 1. College of Pharmacy， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China; 2. Harbin Gloria Pharmaceuticals Co.， Ltd.; Harbin 150040， China; 3. Institute of Natural Resources and Ecology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150040， China ）

Abstract：? To find microbes promoting the biosynthesis of active metabolites in medicinal plants， with Polygonatum sibiricum as materials， the ITS region of fungi form rhizosphere， rhizome and root was sequenced by Illumina MiSeq to analyze the diversity and community composition， and FUNGuild was used to analyze the ecological function categories of endophytes fungi in rhizome. The results were as follows： （1） A total of 1 023 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from all samples of P. sibiricum. The numbers of OTU from rhizosphere， rhizome and root fungi were 703， 128 and 141， respectively. The composition of fungal community in three samples was significantly different， and there was specific fungi Chytridiomycota in root. （2） There was 41 OTU in common of three samples， and Ascomycota accounted for the highest proportion （58.15%）. （3） In ecological functional， endophytic fungi of rhizome in P. sibiricum contained six functions groups， undefined saprotroph， mycoparasites， plant pathogen， animal pathogen， arbuscular mycorrhizal fungi， lichenized fungi， and 37 undefined species （34.91%） had no reference information in the FUNGuild database. It is suggested that the dominant endophytic fungi like Setophoma and Neocosmospora in rhizome may be important microbial communities affecting the biosynthesis of the active products， which provides data reference for the exploration of medicinal functional microorganisms in P. sibiricum.

Key words： Polygonatum sibiricum， endophytic fungi， rhizome， community composition， FUNGuild

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科多年生草本植物，在我國以黑龍江、遼寧、河北、內(nèi)蒙古等地為主產(chǎn)區(qū)（李亞霖等，2019）。黃精以干燥后的根莖入藥，其主要化學成分包括多糖、皂苷、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油等（Zhou et al.， 2019）。黃精是中國傳統(tǒng)中藥材之一，也是重要的藥食同源性植物，具有廣闊的開發(fā)應用前景（Debnath et al.， 2013;國家藥典委員會，2015）。

內(nèi)生菌廣泛存在于不同種類植物組織或器官內(nèi)部，與寄主植物長期協(xié)同進化，并不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出外在病害癥（姚領(lǐng)愛等，2010），主要包括真菌、細菌和放線菌。內(nèi)生菌可以影響藥用植物的生長和發(fā)育（Tan et al.， 2014;郭鳳仙等，2017），并產(chǎn)生與藥用植物活性成分相近的次生代謝產(chǎn)物，如在杜仲中合成抗氧化活性的黃酮類化合物、在刺五加中合成抗氧化的皂苷類物質(zhì)等（郭順星，2018;楊娟等，2019）。目前，有關(guān)藥用植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在丹參（周麗思等，2018）、重樓（王艷等，2019）、虎杖（馬云桐等，2009）、三七（Wu et al.， 2015）等根和根莖入藥的藥用植物。學者對黃精內(nèi)生菌和活性代謝產(chǎn)物的研究甚少，僅見于黃精和多花黃精中三種芽孢桿屬內(nèi)生細菌（HJ-1、HJ-2和ZJU-3）具有抗菌活性（柏曉輝等，2018;遲惠榮等，2019;翟大才等，2019），內(nèi)生真菌的研究見于黃精中鐮刀菌屬、鏈格孢屬和曲霉屬等對多種植物病原菌具有抑制活性（汪瀅等，2010;李艷玲等，2019）。

植物內(nèi)生菌的研究手段主要是應用傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)法，但自然界中90%以上的微生物是不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的（Amann et al.， 1995），現(xiàn)代高通量測序技術(shù)可以快速和正確地分析樣品中微生物群落組成和豐度，并借助生態(tài)功能分析方法從分類學上解析真菌OTUs的生態(tài)功能，從而分析潛在的或可能起功能性作用的非培養(yǎng)類微生物（劉蓬蓬等，2018）。因此，本研究分析黃精根際真菌和藥用部位內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)，探討藥用部位根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能，為黃精藥用功能菌群的發(fā)掘和代謝活性產(chǎn)物的研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品前處理

2019年8月，黃精根際土、根莖和根采自黑龍江省中醫(yī)藥大學藥用植物園，經(jīng)本校藥學院蘇連杰教授鑒定為黃精（Polygonatum sibiricum）。

采集新鮮、無傷病黃精植株3株，將根部土壤抖落后，留存剩余在根部的根際土壤于無菌袋中;所有樣品迅速帶回實驗室后，用流水沖洗掉根莖和根表面多余的根際土后，無菌條件下，將根莖和根切成2 cm小段，置于培養(yǎng)皿中消毒，75%乙醇2 min，5%次氯酸3 min，無菌去離子水沖洗3次，最終獲得根際土、根莖和根的無菌樣品共計9份（王艷等，2019）。

1.2 真菌分子生物學鑒定

利用試劑盒（FastDNA spin kit）提取黃精根際、根莖和根真菌總DNA，每個樣品3次生物學重復。選擇真菌ITS測序通用引物 ITS1/ITS2 進行PCR擴增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（付亞娟等，2019）。PCR產(chǎn)物回收純化后，利用Illumina MiSeq PE300平臺上機測序（美吉生物公司，上海）。

1.3 序列分析和數(shù)據(jù)處理

使用FLASH軟件、QIIME軟件、RDP classifier軟件、Mothur軟件等，對原始下機序列進行生物信息學分析（周家喜等，2019），在相似性97%的水平上，進行可操作分類單元（OTU）劃分。利用 FUNGuild 軟件預測黃精根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能（Nguyen et al.， 2016），為保證預測的準確性，置信水平僅選用highly probable和probable，并刪除序列數(shù)小于10的OTUs。

黃精根際、根莖和根的真菌多樣性指數(shù)和群落組成差異利用SPSS 19.0軟件進行分析，用RStudio v3.5.2的程序包Grid、Venn Diagram、Vegan、ggrepel、ggplot等實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化：韋恩圖（Venn）、主成分分析圖（PCA）、熱圖（Heatmap）和多級物種Sunburst圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精根際及內(nèi)生真菌群落多樣性

黃精根際土、根莖和根共計9個樣品，共獲得623 708條有效序列數(shù)。Coverage指數(shù)接近于1，說明測序結(jié)果可以準確地反映供試樣品的真實情況（表1）。相似度為0.97條件下，黃精根際真菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別為3.77±0.15、460.1±12.1和465.6±10.1，顯著高于根莖和根內(nèi)生真菌（P<0.05），說明黃精根際土中真菌群落多樣性和物種豐富度最高。黃精根莖和根內(nèi)生真菌Simpson指數(shù)顯著高于根際土，說明根莖和根中內(nèi)生真菌群落多樣性較低。

第一和第二主軸解釋了OTU水平真菌群落變化的91.86%，來自相同部位的樣品相對聚集，不同部位樣品中真菌有較高程度的分離，表明黃精根際、根莖和根真菌群落組成差異顯著（圖1）。

2.2 黃精根際及內(nèi)生真菌群落組成

根際土中真菌OTU數(shù)目遠大于根和根莖真菌OTU數(shù)目，分別為703、141、128（圖2）。根際土、根莖和根中共有的OTU數(shù)目為41個，包括真菌類群Setophoma（OTU1332）、籃狀菌屬（Talaromyces）（OTU1449、OTU261）、肉座菌目（Hypocreales）（OTU978、OTU1379）、新赤殼屬（Neocosmospora）（OTU411、OTU1370）等，說明黃精根際土、根莖及根樣品間微生物既存在一定的交集，又相互獨立。根際土與植物中真菌的OTU數(shù)為128，僅占總數(shù)的15.94%，交叉性較小。

黃精根際土、根莖和根中共14門36綱77目158科286屬398種真菌，在門水平主要分布在子囊菌門（Ascomycota）（27.85%～83.98%）、未知菌門（unclassified_k_Fungi）（1.17%～62.58%）、擔子菌門（Basidiomycota）（2.64%～29.06%）、球囊菌門（Glomeromycota）（1.57%～6.68%）、Mortierellomycota（0.19～4.40%）、壺菌門（Chytridiomycota）（1.28%）等6個門中（圖3：a）。藥用部位根莖內(nèi)生真菌中主要分布于子囊菌門（83.98%）和擔子菌門（10.82%）;根莖內(nèi)生真菌子囊菌門的含量顯著高于根際土和根中，根際土中擔子菌門和Mortierellomycota的含量顯著高于根莖和根中，且存在特有的門，即壺菌門（圖3：b）。

從屬水平的分類看（圖4），黃精根際土真菌263屬，顯著高于根莖（72屬）和根（67屬）中內(nèi)生真菌數(shù)量，但在根際土、根莖和根中缺少共有優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥10%）。多級物種Sunburst圖顯示：藥用部位根莖內(nèi)生真菌中相對百分含量前5的有Setophoma（23.71%）、肉座菌目的未鑒定屬（19.36%）、新赤殼屬（8.48%）、棘殼孢屬（Pyrenochaeta）（5.17%）和Cutaneotrichosporon（4.03%），前4屬均屬于優(yōu)勢菌門，即子囊菌門（圖5）。

2.3 共有的類群組成與比較分析

黃精根際土、根莖及根樣品間共有OTU 41個，歸屬于6門12綱24目31科35屬，在門水平上，子囊菌門具有最大相對豐度，占共有真菌的58.15%，其次是未鑒定真菌（22.14%）、擔子菌門（14.24%）、球囊菌門（3.74%）和Mortierellomycota（1.95%）等。

在屬水平上，相對豐度較大的是Setophoma，占共有真菌的13.02%，其次分別是籃狀菌屬（11.34%）、肉座菌目的未鑒定屬（11.12%）、新赤殼屬（5.65%）、角擔菌科（Ceratobasidiaceae）的未鑒定屬（4.23%）、鐮刀菌屬（Fusarium）（2.84%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）的未鑒定屬（2.78%）、球囊霉屬（Glomus）（2.59%）、棘殼孢屬（2.29%）、Cutaneotrichosporon（2.00%）等35屬。

2.4 FUNGuild功能類群預測

除未鑒定菌群外，黃精藥用部位根莖內(nèi)生真菌（刪除OTU<10）共有106個OTU，劃分為6個生態(tài)功能群（圖6），分別是（1）未定義腐生菌（undefined saprotroph）和未定義腐生菌-木腐生菌（undefined saprotroph-wood saprotroph）：共27個OTU，占總OTU數(shù)量的25.47%，相對豐度高達44.85%，是黃精根莖中最主要的功能類群，在屬水平上包括曲霉屬（Aspergillus）（3 OTU）、新赤殼屬（2 OTU）、籃狀菌屬（2 OTU）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（2 OTU）、Dactylonectria（1 OTU）和青霉屬（Penicillium）（1 OTU）等。（2）寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌（fungal parasite-plant pathogen-wood saprotroph）：3個OTU，在屬水平上是Setophoma（2 OTU）、Paraphoma（1 OTU），占總OTU數(shù)量的2.83%，但其相對豐度高達24.32%。（3）動物病原菌（animal pathogen）：僅有2個OTU，在科水平均屬于油壺菌科（Olpidiaceae）。（4）植物病原菌（plant pathogen）：6個OTU，在屬水平上分別是小球腔菌屬（Leptosphaeria）（1 OTU）、螺旋聚孢霉屬（Clonostachys）（1 OTU）和赤霉屬（Gibberella）（2 OTU）等。（5）叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）：11個OTU，均屬于球囊菌門（Glomeromycota）。（6）地衣共生真菌（lichenized fungi）：僅有1個OTU被認為是地衣共生真菌，屬于擬星衣科（Arthopyreniaceae）。另外，19個OTU在FUNGuild數(shù)據(jù)庫的置信水平為possible，故不進行功能統(tǒng)計，并且有37個OTU（占比34.91%）中沒有參考信息。

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與藥用植物相同或相似的活性成分（Tian et al.， 2014; Sunil et al.， 2018），研究者已從黃精中分離出可合成具有抗菌活性的三萜皂苷的內(nèi)生真菌（汪瀅等，2010;姜程曦等，2017），我們利用高通量測序手段從黃精根際土、根莖和根中測序得到豐富的內(nèi)生真菌群，其中鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬、曲霉屬和青霉屬已經(jīng)在泰山黃精中通過傳統(tǒng)的平板分離的方法獲得（李艷玲等，2013），但相對豐度較低，除此之外，我們發(fā)現(xiàn)黃精中大量的內(nèi)生真菌還未見報道有待深入發(fā)掘，可見高通量測序手段較傳統(tǒng)的菌落分離，更能全面反映樣品內(nèi)生真菌群落的結(jié)構(gòu)組成，與Siddique et al.（2017）意見一致。

土壤真菌以植物根系作為中間體，并以菌絲或者孢子的形式，通過植物側(cè)根的裂縫、氣孔或者根部的破損等處進入植物的根和根莖中，參與藥用植物活性成分的合成（周家喜等，2019）。黃精根際土真菌與植物內(nèi)生真菌共有128個OTU，占植物總OTU的56.64%，說明土壤和植物中的真菌存在一定的相似性，根際真菌有機會選擇性地進入到植物體內(nèi)，并成為內(nèi)生真菌，與周婕等（2019）對紫莖澤蘭根部與根際真菌的研究結(jié)果一致。同時，共有OTU僅占根和根莖內(nèi)生真菌的29.07%和32.03%，說明除了共有成分外，在黃精根和根莖中擁有更多獨立的真菌類群，這與王艷等（2019）對重樓內(nèi)生真菌的研究結(jié)果一致，認為植物內(nèi)部有其自身特殊的生境，是植物與微生物間協(xié)同進化的結(jié)果。

FUNGuild預測結(jié)果顯示，黃精根莖中未定義腐生菌類群（相對豐度44.85%）占比最高，與周家喜等（2019）、熊丹等（2020）的研究結(jié)果一致，認為未定義腐生菌是地下部分根和根莖中的主要功能類群，并且很多研究發(fā)現(xiàn)腐生菌類群能夠參與有機物降解（Yan et al.， 2018;Chen et al.， 2019）。植物內(nèi)生真菌在發(fā)育學上不穩(wěn)定，在植物的不同生活周期中扮演不同的角色，一些具有復雜生活史的真菌有多種功能營養(yǎng)型可以相互轉(zhuǎn)化，采取不同的生存策略來適應環(huán)境的改變（Arnold & Lutzoni， 2007），在FUNGuild分類上可以被劃分多種營養(yǎng)方式（熊丹等，2020）。在本研究中，優(yōu)勢菌屬Setophoma（相對豐度23.71%）被認定是寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌，推測其在植物組織健康生長的時候是寄生真菌，有增加植物生長量的能力，但也可以產(chǎn)生植物毒性成分導致植物生長受到抑制， 但當組織衰老或死亡時可能作為腐生真菌，參與有機物降解，與丁常宏等（2013）的意見一致。

黃精根莖內(nèi)生真菌中3個OTU屬于新赤殼屬（相對豐度8.48%），被劃分為未定義腐生菌，Matsuo et al.（2019）發(fā)現(xiàn)新赤殼屬真菌具有抗腫瘤和抗瘧疾的活性，以及清除或淬滅活性氧（ROS）的能力;黃精根莖中球囊菌門的11個OTU，均被劃分為叢枝菌根真菌，已有學者發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌與植物互惠共生，提高萜類、生物堿等藥用植物活性成分的產(chǎn)量（于洋等，2013;謝偉等，2020），尤其曹冠華等（2019）發(fā)現(xiàn)滇黃精根莖中多糖、薯蕷皂苷元含量與叢枝菌根真菌呈顯著正相關(guān)，這說明黃精入藥部位根莖中的優(yōu)勢內(nèi)生真菌可能與活性代謝產(chǎn)物合成有關(guān)。我們今后還需進一步加強菌株分離和功能試驗，對黃精有效部位根莖中微生物的有效成分合成代謝進行更加深入的研究。

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（責任編輯 周翠鳴）

收稿日期：? 2020-07-22

基金項目： 國家自然科學基金（81973440） [Supported by the National Natural Science Foundation of China （81973440）]。

作者簡介： 樊銳鋒（1980-），博士，副教授，主要從事藥用植物及資源利用研究，（E-mail）ruifeng-fan@163.com。

通信作者： 黃慶陽，博士，副研究員，碩士研究生導師，研究方向為植物學，（E-mail）huangqingyang@163.com。