溫帶臭蟲細(xì)胞色素P450 CYP4C1蛋白生物信息學(xué)分析

雷廷 李敏 李榮榮 程璟俠

摘 要：為闡明CYP4家族基因在溫帶臭蟲（Cimex lectularius）解毒代謝機(jī)制中的作用，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)溫帶臭蟲CYP4C1蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得溫帶臭蟲CYP4C1基因與CYP4C1蛋白序列信息，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)CYP4C1基因、CYP4C1蛋白進(jìn)行分析;并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，溫帶臭蟲CYP4C1的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)為1053bp，編碼500個(gè)氨基酸;第5～23位氨基酸為疏水區(qū);不穩(wěn)定指數(shù)為37.85;在5～27位氨基酸之間形成1個(gè)典型的跨膜區(qū);無信號(hào)肽結(jié)構(gòu);亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中;具19個(gè)磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)糖基化位點(diǎn)以及4個(gè)N-?；稽c(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，主要結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋和無規(guī)卷曲;含3個(gè)二硫鍵;含P450結(jié)構(gòu)功能域。

關(guān)鍵詞：溫帶臭蟲;CYP4C1蛋白;結(jié)構(gòu);功能;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) R384文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）07-0018-06

Bioinformatics Analysis of CYP4C1 Protein in Cytochrome P450 of Cimex lectularius

LEI Ting1 et al.

（1Department of Biology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030031， China）

Abstract： To illuminate the foundation for elucidating the role of CYP4 family genes in the detoxification and metabolism of Cimex lectularius， bioinformatic softwares were applied to predict and analyze the structure and biological characteristics of the CYP4C1 protein. The sequence information was obtained from GenBank database. CYP4C1 and CYP4C1 protein were analyzed by bioinformatics software. And the phylogenetic tree was conducted. The results showed that the full-length of CYP4C1 cDNA is 1053 bp long， encoding 500 amino acids; the predicted hydrophobic region is 5-23 and the instability index is 37.85; the transmembrane region is 5 to 27; it has no signal peptides and the subcellular localization analysis indicates it exists in cytoplasm; .it contains 19 phosphorylation site， 3 glycosylation sites and 4 N-acylation sites; its secondary structure is composed mainly of α-helix and random coil; protein domain prediction shows that it contains the P450s structural domain.

Key words： Cimex lectularius; CYP4C1 protein; Structure; Function; Bioinformatics

溫帶臭蟲（Cimex lectularius）是隸屬于半翅目（Hemiptera）臭蟲科（Cimicidae）臭蟲屬（Cimex）的一類無翅昆蟲，與人類密切相關(guān)，主要靠吸食人血為生，晝伏夜出，叮咬人體的皮膚后，可以致使部分皮膚受到損傷，出現(xiàn)紅腫、瘙癢等癥狀，部分人可能發(fā)生激烈的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)丘疹樣蕁麻疹[1]。溫帶臭蟲在全世界范圍內(nèi)均有分布，近十幾年來，溫帶臭蟲在歐洲、北美、澳大利亞和亞洲等部分發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)重新出現(xiàn)[2-4]。我國(guó)部分地區(qū)，溫帶臭蟲也日趨常見，有廣泛發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[5]?，F(xiàn)階段，臭蟲防治的主要方法是噴灑化學(xué)殺蟲劑，然而隨著殺蟲劑的大量應(yīng)用，大多數(shù)臭蟲對(duì)不同的殺蟲劑有了明顯的抗性[6-7]，使得臭蟲的防治進(jìn)入新階段。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系由多個(gè)基因家族組成，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物等生物體不同的細(xì)胞和組織中，是一類末端加氧酶，參與生物體內(nèi)源性有害物質(zhì)以及殺蟲劑等外源性有害物質(zhì)的代謝，在昆蟲中主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相結(jié)合發(fā)揮作用。近年來，細(xì)胞色素P450的結(jié)構(gòu)和功能研究取得很大的進(jìn)展，尤其是其在藥物代謝中發(fā)揮的作用。在昆蟲抗性種群中，P450基因顯著過量表達(dá)，提示其發(fā)揮的代謝解毒作用是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制之一，一般認(rèn)為CYP6家族成員與昆蟲抗殺蟲劑的能力關(guān)系最為密切[8-10]。但近年來報(bào)道，在具抗藥性的昆蟲體內(nèi)，CYP4家族的基因過量表達(dá)，表明CYP4家族在昆蟲的解毒代謝中也發(fā)揮重要作用[11-12]。

本研究通過生物信息學(xué)軟件分析方法對(duì)溫帶臭蟲基因組CYP4C1及CYP4C1蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在為進(jìn)一步從分子水平研究溫帶臭蟲細(xì)胞色素P450基因功能奠定基礎(chǔ)，以期為溫帶臭蟲的綜合防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 溫帶臭蟲CYP4C1基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列來自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)?；蛐蛄蠧YP4C1登錄號(hào)為XM_014386381.2，蛋白序列CYP4C1登錄號(hào)為XP_014241867.1。將蛋白序列在NCBI中做Protein BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對(duì)，選取Swiss-port數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，算法采用blastp（protein-protein BLAST），以確定CYP4C1蛋白序列的正確性。

1.2 CYP4C1基因序列分析 利用NCBI網(wǎng)站的在線預(yù)測(cè)工具ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）對(duì)基因的開放閱讀框進(jìn)行分析;使用BioEdit v7.2.5對(duì)核酸序列組分進(jìn)行分析;使用CodonW1-4-2軟件分析密碼子使用率。

1.3 CYP4C1蛋白質(zhì)序列分析 分別使用ExPASy的ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、親疏水性分析;采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè);使用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;利用TargetP 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè);使用ExPASy中的ScanProsite（https：//prosite.expasy.org/）對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);使用Scratch Protein Predictor（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）中的DIpro預(yù)測(cè)二硫鍵的位置;運(yùn)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域;利用SWISS-MODEL（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 選取相似率大于45%的半翅目昆蟲CYP4C蛋白序列，以黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）CYP4C3蛋白序列為外群，使用MEGA X軟件采用鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，替換模型為p-distance，位點(diǎn)進(jìn)化速率為Gamma distributed，1000次重復(fù)計(jì)算bootstrap（BP）值（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP4C1基因序列分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得溫帶臭蟲CYP4C1基因的cDNA序列，登錄號(hào)為XM_014386381.2，長(zhǎng)度為1712bp。經(jīng)ORF Finder在線工具分析，最長(zhǎng)的開放閱讀框?yàn)?503bp，編碼500個(gè)氨基酸（圖1）。編碼區(qū)核酸序列組分分析結(jié)果顯示分子質(zhì)量是455.6kDa（單鏈狀態(tài)）909.9kDa（雙鏈狀態(tài)），GC含量為35.06%，AT含量為64.94%。

2.2 CYP4C1基因密碼子使用相對(duì)概率 密碼子使用相對(duì)概率（RSCU）值反映密碼子在所編碼的氨基酸的同義密碼子中出現(xiàn)的頻率。結(jié)果顯示CYP4C1共含有501個(gè)密碼子，4種密碼子使用最普遍，依次為AAA-Lys、GAA-Glu、AUU-Ile和UUU-Phe，其中3種均由A或T組成。3種最主要的氨基酸分別為L(zhǎng)eu（61）、Ile（45）和Lys（40）。

2.3 CYP4C1蛋白基本理化性質(zhì) 根據(jù)CYP4C1蛋白在BLAST中比對(duì)結(jié)果，顯示其確定為CYP4C1蛋白。ProtParam軟件分析表明，CYP4C1編碼的蛋白的分子式為C2656H4152N668O735S20，理論相對(duì)分子質(zhì)量為57.8kDa，理論等電點(diǎn)為8.43，不穩(wěn)定指數(shù)為37.85，根據(jù)Guruprasad方法表明CYP4C1蛋白為穩(wěn)定蛋白[13]。脂肪指數(shù)為98.84。在組成該蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，為12.2%，色氨酸（Trp）含量最低，為0.8%。CYP4C1蛋白含有56個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，60個(gè)帶正電荷的殘基。

2.4 親疏水性 ProtScale在線分析蛋白質(zhì)的親疏水性（圖2），在N端5-23位氨基酸之間為疏水性區(qū)域，且在第12位氨基酸疏水性達(dá)到最強(qiáng)，疏水指數(shù)為3.789，最低值-2.644出現(xiàn)在253位，平均疏水指數(shù)為-0.120，為親水性蛋白。

2.5 跨膜區(qū)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位 使用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)CYP4C1蛋白第5～27個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)域（圖3），表明該蛋白為跨膜蛋白。使用SignalP 5.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，顯示該蛋白質(zhì)無信號(hào)肽（圖4）。運(yùn)用TargetP 2.0 Server進(jìn)行的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，CYP4C1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.6 翻譯后修飾位點(diǎn) 使用ScanProsite對(duì)翻譯后修飾位點(diǎn)結(jié)果預(yù)測(cè)顯示，CYP4C1蛋白存在11個(gè)蛋白激酶C磷酸位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)以及4個(gè)N-?；稽c(diǎn)（表3）。

2.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用SOPMA在線預(yù)測(cè)溫帶臭蟲CYP4C1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：α–螺旋占比最大，占比為49%，無規(guī)卷曲占比為35.8%，β–轉(zhuǎn)角占比為3.4%，延伸鏈占比為11.8%（圖5）。使用DIpro預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二硫鍵的數(shù)量及形成位置（表4）。

2.8 結(jié)構(gòu)功能域 使用SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域分析顯示CYP4C1蛋白34～495位之間含高度保守的P450結(jié)構(gòu)功能域，包括5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG。溫帶臭蟲CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1個(gè)氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6個(gè)、第8個(gè)和第9個(gè)氨基酸分別被蘇氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替（圖1）。

2.9 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu) 通過SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)CYP4C1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），模板序列與預(yù)測(cè)序列的模型相似度為32.25%，對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估的GMQE為0.66，表明預(yù)測(cè)所得的三級(jí)結(jié)構(gòu)是可靠的。

2.10 系統(tǒng)發(fā)育分析 選擇溫帶臭蟲和其它16種半翅目昆蟲的CYP4C同源序列，以黑腹果蠅作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），結(jié)果顯示溫帶臭蟲Cl CYP4C1與紅獵蝽屬物種Rhodnius neglectus Rn CYP4C3關(guān)系較近，bootstrap值為85%。其余端部分支bootstrap值均為100%。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞色素P450是一個(gè)可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白超家族，廣泛表達(dá)于產(chǎn)生抗藥性的昆蟲品系中，證實(shí)是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的原因之一[14]。昆蟲的CYP蛋白質(zhì)的分子量大多位于55～65kD之間[15-16，17]，本研究中，溫帶臭蟲CYP4C1基因編碼區(qū)包含1503bp，編碼500個(gè)氨基酸，分子量為57.8kD，位于上述范圍內(nèi)。軟件ProtParam tool、TMHMM Server v.2.0和SOPMA預(yù)測(cè)溫帶臭蟲CYP4C1蛋白第5～23/5～27位氨基酸為疏水/跨膜區(qū)，且主要由α-螺旋組成，這與蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)一般是由疏水性氨基酸組成的α-螺旋一致[18]，推測(cè)CYP4C1蛋白在與磷脂層錨定結(jié)合上起到重要的作用。細(xì)胞色素P450主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上，亞細(xì)胞定位顯示該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)包括細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞器和內(nèi)含物，但該蛋白定位仍需進(jìn)一步研究。

二硫鍵（S-S）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵，起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用，本研究預(yù)測(cè)溫帶臭蟲CYP4C1蛋白含3個(gè)二硫鍵，表明該蛋白質(zhì)分子對(duì)抗外界壓力的穩(wěn)定性較高。在生物體內(nèi)有功能的蛋白質(zhì)通常在翻譯結(jié)束后要經(jīng)過多次位點(diǎn)修飾。有研究表明，蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，如基因的表達(dá)、糖代謝、細(xì)胞生存周期等生命活動(dòng)[19-20]。本研究中，ScanProsite分析溫帶臭蟲CYP4C1蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)，該蛋白含有11個(gè)蛋白激酶C磷酸位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，說明其可能受到蛋白磷酸激酶的調(diào)控。

CYP4C1蛋白含有P450家族共有的保守結(jié)構(gòu)域：WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG[21]，與SMART預(yù)測(cè)的34～495位之間含高度保守的P450結(jié)構(gòu)功能域一致，但溫帶臭蟲CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1個(gè)氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6個(gè)、第8個(gè)和第9個(gè)氨基酸分別被蘇氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替，這可能與不同物種有關(guān)。

溫帶臭蟲CYP4C1與紅獵蝽屬物種Rhodnius neglectus CYP4C3的一致率和相似率最高，分別為48.7%和67.3%，在基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，兩者也聚為一支，且bootstrap值為85%，這或許與兩者都具吸血習(xí)性有關(guān)。

本研究基于多種生物信息學(xué)軟件，全面分析了溫帶臭蟲CYP4C1蛋白序列特征，預(yù)測(cè)了蛋白功能，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，為溫帶臭蟲的殺蟲劑抗性分子機(jī)制研究提供了一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)編：王慧晴）