油酸囊泡尺度多分散性及二元醇對其pH窗口的影響

樊 曄，范夢琦，方 云，李 磊，潘紅陽，夏詠梅

（1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無錫 214122）

脂肪酸囊泡（FAV）獨(dú)特的中空［1］和脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)［2，3］可有效包載各種酶、藥物或其它大分子，在藥物載體［4］、史前細(xì)胞膜模型［5，6］、微反應(yīng)器［7］及制備納米粒子［8，9］等方面具有重要應(yīng)用前景，但FAV僅在其砌塊脂肪酸的表觀pKa附近很窄的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定［5，10］，使理論研究和應(yīng)用均受到限制.研究發(fā)現(xiàn)脂肪醇類會(huì)拓寬FAV形成的堿性pH窗口［11～16］，而含多羥基的烷基糖苷則會(huì)拓寬FAV的酸性pH窗口［17］.同屬含羥基的長鏈極性物同樣借助疏水插入，但拓寬pH窗口的效果卻不相同，這一現(xiàn)象引起研究者對介于兩者之間的二元醇的興趣.現(xiàn)已有多官能團(tuán)小分子［18，19］對pH窗口影響的報(bào)道，如油酸和二乙烯三胺的混合體系在pH=8.0～11.5間均存在囊泡相［20］，表明拓寬其堿性pH窗口，但尚未見二元醇影響脂肪酸囊泡化的研究.油酸（OA）是一種天然不飽和脂肪酸，成本低廉、生物相容性好.1973年，Gebicki和Hicks［21］首次報(bào)道了OA囊泡的形成，其形成FAV的pH范圍為8.2～10.0［22］，目前OA囊泡是研究最多的一類FAV，由于表征手段的局限，通常認(rèn)為其多形成微米級(jí)的多層巨囊泡［20～22］.因此，本文以O(shè)A為模型脂肪酸，利用多種尺度的形貌表征方法表征OA囊泡的尺度多分散性，并考察了系列短鏈二元醇對其形成FAV的pH窗口的影響，以期探究二元醇的碳橋長度與FAV的pH窗口間的構(gòu)效關(guān)系.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

油酸（A.R.級(jí)），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇（A.R.級(jí)），上海泰坦科技股份有限公司；1，3-丙二醇（純度98%），上海麥克林生化科技有限公司；1，4-丁二醇（A.R.級(jí)）和1，2-己二醇（純度99.3%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，6-己二醇（純度98%）和甘油（A.R.級(jí)），北京伊諾凱科技有限公司；其它試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）利用美國Millipore Synergy UV超純水系統(tǒng)自制.

VHX-1000C型超景深三維顯微鏡，Keyence（香港）有限公司；TSC-SP8型激光共聚焦顯微鏡（CLSM），德國Leica公司；EM ACE900型冷凍斷裂設(shè)備，德國Leica公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL株式會(huì)社；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)，上海宇隆儀器有限公司；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司.

1.2 FAV的pH窗口確定

參考文獻(xiàn)［23］的方法測定二元醇-OA堿性水溶液的pH滴定曲線.用0.1 mol/L的NaOH溶液配制二元醇-OA儲(chǔ)備液200 mL，其中OA濃度為5 mmol/L，二元醇與OA的摩爾比在0.1～1.0間變化.將儲(chǔ)備液按每份7 mL進(jìn)行等分，每份置于樣品瓶中，向其中加入不同體積的0.1 mol/L的HCl溶液，并用超純水補(bǔ)充至8 mL，混勻后在室溫下靜置24 h后精確測定各樣品溶液的pH值和電導(dǎo)率（k），繪制pH曲線和電導(dǎo)率曲線.依據(jù)目測激光丁達(dá)爾現(xiàn)象在pH滴定曲線上劃分相區(qū)，確定形成FAV的pH窗口，并用電導(dǎo)率曲線驗(yàn)證.而確定參照物OA（5 mmol/L）的pH窗口時(shí)僅依據(jù)目測激光丁達(dá)爾現(xiàn)象和pH滴定曲線.

1.3 FAV的制備及超景深三維顯微鏡表征

用0.1 mol/L的NaOH溶解OA，配制5 mmol/L的OA溶液50 mL，以微量HCl調(diào)節(jié)體系pH值為8.7，混勻后在室溫下靜置自組裝24 h制備OA囊泡.二元醇-OA囊泡的制備方法與之類似，其中OA濃度為5 mmol/L，二元醇與OA的摩爾比在0.1～1.0間變化.取5μL上述FAV溶液滴于載玻片上，用超景深三維顯微鏡觀察FAV的形貌及粒徑.

1.4 熒光染色法激光共聚焦顯微鏡的表征

將16μL 0.1%尼羅紅溶液或羅丹明B溶液加入到上述8 mL的OA囊泡溶液（pH=8.7）中，靜置24 h對FAV染色.將羅丹明B染色的FAV溶液裝入透析袋（截留分子量3500）中，置于200 mL pH=8.7的水溶液中，于37℃和80 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器中透析2 h.取8μL染色FAV溶液滴于載玻片上，封片處理后將載玻片倒置放在樣品臺(tái)上，用CLSM觀察FAV的形貌及粒徑.

1.5 冷凍刻蝕-透射電子顯微鏡的表征

將上述pH=8.7的OA囊泡溶液用液氮瞬間冷凍，并迅速轉(zhuǎn)移至-150℃下冷凍斷裂設(shè)備內(nèi)進(jìn)行低溫高真空劈裂和制備噴鍍復(fù)型膜，Pt/C沉積角度為45°，碳沉積角度為90°.將復(fù)型膜轉(zhuǎn)移到碳支持膜（T10023，北京新興百瑞有限公司）上，并在加速電壓200 kV下用冷凍刻蝕-透射電子顯微鏡（FFTEM）觀察FAV的形貌及粒徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 油酸囊泡的pH窗口確定

圖1中OA的pKa值約為9.2，當(dāng)pH＞10.1時(shí)，OA溶液澄清透明，代表膠束相形成.pH在pKa附近時(shí)，體系呈現(xiàn)強(qiáng)烈的乳光且具有明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象，推斷其進(jìn)入囊泡相［23～25］.pH＜8.2時(shí)，體系呈乳液狀態(tài)并逐漸過渡到有油相析出，推斷形成OA囊泡的pH范圍為8.2～10.1，這與文獻(xiàn)［22］的報(bào)道基本一致.

Fig.1 pH titration curve of the alkaline solution of oleic acid(5 mmol/L)and observation of Tyndall effects corresponding to different phase regions(inset)

2.2 油酸囊泡尺度多分散性的表征

采用多種尺度的形貌表征手段表征了OA囊泡的形貌和尺度.從圖2（A）的OA囊泡的光學(xué)顯微照片可以觀察到5μm左右的中空球體，初步推斷為OA囊泡，并得到CLSM影像的佐證：圖2（B）和（C）為油溶性尼羅紅［26］染色后樣品的CLSM明場和暗場照片，均能夠觀察到與圖2（A）相似的、清晰的中空結(jié)構(gòu)，這是由于尼羅紅被增溶在FAV的疏水殼層中.圖2（D）和（E）為水溶性羅丹明B［27］染色后樣品的CLSM明場和暗場照片，均觀察到實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)，這是由于羅丹明B被包埋在FAV的內(nèi)腔中.圖2（B）和（D）中其它亮度不同的紅色小點(diǎn)可能是不在CLSM分辨率范圍內(nèi)的更小的囊泡.圖3中FF-TEM表征發(fā)現(xiàn)，體系中微米［圖3（A）和（B）］、亞微米［圖3（C）和（D）］和納米［圖3（E）和（F）］尺度的FAV共存，其中微米和亞微米級(jí)尺度的OA囊泡為多層囊泡［圖3（A）～（C）］，根據(jù)1個(gè)典型囊泡估計(jì)其壁厚為11.5 nm［圖3（D）］，遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)［25］報(bào)道的OA單層囊泡的壁厚（3.6±0.8）nm；而圖3（E）和（F）中粒徑約為90 nm的納米尺度OA囊泡更接近單層囊泡.上述結(jié)果表明，OA囊泡呈現(xiàn)從幾十納米至數(shù)微米的尺度多分散性，而且其粒徑比我們［28］前期研究的共軛亞油酸囊泡大，符合脂肪酸飽和度越高，形成的FAV粒徑越大的規(guī)律［29］.

Fig.2 Optical micrograph(A)and confocal laser microscope(CLSM)images of oleic acid vesicles in bright(B)and dark(C)field stained with Nile Red,bright(D)and dark(E)field stained with Rhodamine B

Fig.3 FF-TEMimages of oleic acid vesicles(pH=8.7)

2.3 二元醇對FAV的pH窗口的影響

由圖4可見，乙二醇-OA混合體系的外觀隨著pH降低遵從透明-乳光-渾濁-油滴的變化規(guī)律［21，22］，對應(yīng)于膠束-囊泡-乳液-分相的相區(qū)遞進(jìn).囊泡相具有明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象且電導(dǎo)率曲線的谷底對應(yīng)于囊泡相，因此結(jié)合三者判斷二元混合體系形成FAV的pH窗口，結(jié)果列于表1.

通過超景深三維顯微鏡驗(yàn)證了pH窗口兩端FAV的存在（圖5）.不同乙二醇添加量的FAV的pH窗口均在8.0～11.7左右，圖5（A）表明其pH窗口兩端均存在（5±2）μm的FAV.而OA自身的囊泡化pH范圍為8.2～10.1，說明乙二醇的加入能夠使囊泡化pH窗口明顯向堿性拓寬，圖5（B）～（F）證實(shí)加入其它二元醇后OA在各自相應(yīng)的pH窗口兩端處均存在FAV.

Fig.4 pH titration curves,conductometric curves and observation of Tyndall effects of diol-OA(molar ratio 0.1∶1.0)aqueous solutions composed of ethylene glycol(A),1,3-propanediol(B),1,4-butanediol(C),1,6-hexanediol(D),1,2-hexanediol(E)and glycerol(F)

表1結(jié)果表明，加入二元醇總體上使FAV的pH窗口有所拓寬，但未觀察到改變二元醇加入量的明確效應(yīng).二元醇使FAV更穩(wěn)定的原因可能為：（1）二元醇插入多層囊泡的層間分別與相鄰雙分子層的內(nèi)外葉發(fā)生氫鍵作用將有利于FAV穩(wěn)定；（2）pH窗口的拓寬方向?qū)⒂啥嫉牧u基在FAV表面的作用方式?jīng)Q定，可能的作用機(jī)制如Scheme 1所示.表1中乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇影響FAV的pH窗口平均在8.0～11.5，即堿性窗口從10.1拓寬到11.5，表明三者與OA分子的作用機(jī)理基本一致，這可能是由于它們分子中的碳橋較短，但自由度較大，2個(gè)羥基與FAV表面的羧基通過雙位點(diǎn)氫鍵結(jié)合后沒有自由羥基，雖然這幾乎不能增強(qiáng)酸性pH窗口一側(cè)囊泡表面的微極性，因此酸性pH窗口拓寬不明顯，但是在堿性pH窗口一側(cè)通過屏蔽OA的羧酸根間的靜電斥力，使OA分子所占界面面積減小且堆積參數(shù)P增大，從而拓寬堿性pH窗口.表1中2種己二醇和甘油均使FAV的酸性pH窗口從8.2拓寬到7.6左右，但對堿性pH窗口的影響則不盡相同，除了1，6-己二醇能使其略微拓寬到10.5左右外，其它兩種均無作用.可能的影響機(jī)制也示于Scheme 1：（1）1，6-己二醇采取Bola型的疏水插入方式在酸性pH窗口發(fā)揮了類似APG［17］的作用，2個(gè)自由羥基增加了囊泡表面環(huán)境的親水性，從而稍微拓寬酸性pH窗口；而在堿性pH窗口其間隔的二元羥基排布在表面上發(fā)揮了類似長鏈脂肪醇［13］的作用，屏蔽了OA的羧酸根間的靜電斥力，使其所占界面面積減小且P參數(shù)增大，故稍微拓寬堿性pH窗口，導(dǎo)致了pH窗口雙向拓寬的效果；（2）1，2-己二醇的疏水插入方式無論在酸性或堿性pH窗口均發(fā)揮了類似APG［17］的作用，因此只能拓寬酸性pH窗口，且疏水插入后囊泡表面的自由羥基比APG少，故無論是酸性pH窗口拓寬還是堿性pH窗口收縮均不如APG明顯；（3）由于甘油的空間密集的三羥基構(gòu)造使其可能也像短鏈二元醇一樣與囊泡表面發(fā)生雙位點(diǎn)氫鍵結(jié)合或單位點(diǎn)氫鍵結(jié)合，殘留的自由羥基的作用更接近于1，2-己二醇，因此只能略微拓寬酸性pH窗口.

Scheme 1 Schematic illustration of the mechanism for FAV formation of diol-OA vesicles

Table 1 pH window for FAV formation of diol-OA mixed systems

Fig.5 Optical micrographs of diol-OA(molar ratio 0.1∶1.0)vesicles on the acidic(A—F)and the alkaline(A′—F′)pH window composed of ethylene glycol(A,A′),1,3-propanediol(B,B′),1,4-butanediol(C,C′),1,6-hexanediol(D,D′),1,2-hexanediol(E,E′)and glycerol(F,F′)pH:(A)8.1;(A′)11.6;(B)8.0;(B′)11.4;(C)7.9;(C′)11.6;(D)7.6;(D′)10.7;(E)7.7;(E′)9.8;(F)7.5;(F′)10.2.

3 結(jié) 論

依據(jù)目測激光丁達(dá)爾現(xiàn)象在pH滴定曲線上劃分相區(qū)，確定OA囊泡形成的pH范圍為8.2～10.1.用光學(xué)顯微鏡、CLSM并結(jié)合FF-TEM證明了pH=8.7的OA溶液中微米、亞微米和納米尺度的囊泡共存，且微米和亞微米級(jí)FAV為多層囊泡，納米級(jí)FAV為單層囊泡，呈現(xiàn)尺度多分散性特征.依據(jù)目測激光丁達(dá)爾現(xiàn)象在pH曲線上劃分相區(qū)，確定二元醇-OA囊泡的pH窗口，并由電導(dǎo)率曲線驗(yàn)證，探究了短鏈二元醇的碳橋長度與FAV的pH窗口拓寬之間的構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果表明，乙二醇、1，3-丙二醇及1，4-丁二醇均只能拓寬FAV的堿性pH窗口，碳橋增長的1，6-己二醇使FAV的pH窗口向兩端拓寬，而羥基位置及數(shù)目不同的1，2-己二醇和甘油均只能拓寬FAV的酸性pH窗口.因此，短鏈二元醇總體而言有助于FAV的pH窗口拓寬，而拓寬的方向取決于二元醇與OA囊泡的表面氫鍵作用方式或疏水插入方式，以及作用后二元醇在FAV表面殘留的自由羥基數(shù).在酸性條件下FAV表面殘留的羥基多有助于拓寬酸性pH窗口.在堿性條件下表面殘留的羥基若能有效屏蔽OA離子間的靜電斥力，則有助于拓寬堿性pH窗口.因此，二元醇碳橋長度對OA囊泡化pH窗口的表觀影響，本質(zhì)上由兩者間的相互作用方式?jīng)Q定.本文為選擇可調(diào)控FAV的pH窗口的二元醇提供了理論依據(jù)，也為開發(fā)FAV作為緩釋載體提供了參考.