石墨烯量子點(diǎn)熒光探針對(duì)堿性磷酸酶活性的高效檢測(cè)

黃 珊，姚建東，寧 淦，肖 琦，劉 義，2

（1.南寧師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院,廣西天然高分子化學(xué)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530001；2.天津工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,天津 300387）

石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）是一種具有石墨烯結(jié)構(gòu)的新型熒光納米材料［1］.與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，GQDs具有抗光漂白性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低、生物相容性好和熒光性能優(yōu)良等優(yōu)勢(shì)［2，3］，在生物傳感、生物成像和光電器件等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［4，5］.GQDs熒光探針因其獨(dú)特的熒光性能，被廣泛用于多種蛋白酶的活性檢測(cè)，如酪氨酸酶［6］、胰蛋白酶［7，8］、乙酰膽堿酯酶［9］、酸性磷酸酶［10］及堿性磷酸酶（ALP）［11，12］等.

ALP是一種具有磷酸底物特異性的水解酶，可以催化堿性介質(zhì)中多種含磷化合物的水解或去磷酸化.血清ALP水平紊亂已被證明可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，如動(dòng)態(tài)骨病、前列腺癌、乳腺癌、肝功能障礙和糖尿病等［13］.因此，ALP常被作為重要的生物標(biāo)志物用于多種疾病的臨床診斷［14］.在生物學(xué)分析中，ALP可用作反應(yīng)中的酶標(biāo)記或指示劑，以量化免疫測(cè)定和基因測(cè)試或其它方法的組合過程［15］.為了更好地了解ALP在臨床實(shí)踐和相關(guān)生物學(xué)過程中的作用，迫切需要開發(fā)靈敏、簡(jiǎn)單且可靠的ALP活性檢測(cè)方法.目前，ALP活性的檢測(cè)方法主要包括比色法［15］、熒光分析法［11，13］、電化學(xué)分析法［16，17］和表面增強(qiáng)拉曼散射法［18］等.其中，熒光分析法因其快速、簡(jiǎn)單和靈敏的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力而具有較大的檢測(cè)優(yōu)勢(shì).銅-鄰二氮菲配合物［19］、聚多巴胺納米粒子［20，21］、鈷氫氧化物-銅納米團(tuán)簇［22］、銀納米團(tuán)簇［23］、金納米粒子［24］、二硫化鉬量子點(diǎn)［25］和碳量子點(diǎn)［26］等熒光探針被廣泛用于ALP活性的檢測(cè).然而，常見熒光染料的熒光穩(wěn)定性較差，熒光納米材料又存在合成條件苛刻、成本高等不足，限制了這些熒光探針的進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用.因此，尋找合適的熒光探針來有效檢測(cè)ALP活性仍具有一定的挑戰(zhàn).

本文基于苯醌類物質(zhì)能靜態(tài)猝滅GQDs熒光的特性，建立了一種利用GQDs熒光探針高效檢測(cè)ALP活性的新方法.如Scheme 1所示，過氧化氫（H2O2）在辣根過氧化物酶（HRP）催化作用下產(chǎn)生·OH，強(qiáng)氧化性的·OH能將鄰苯二酚（o-DHB）氧化成鄰苯醌（o-benzoquinone）并猝滅GQDs的熒光［3］.抗壞血酸-2-磷酸（AAP）能被ALP催化降解生成抗壞血酸（AA），具有強(qiáng)還原性的AA可有效清除溶液中的H2O2和·OH［3］，進(jìn)而抑制鄰苯醌的生成，誘使GQDs的熒光恢復(fù).隨著ALP活性的增大，在440 nm處的熒光不斷增強(qiáng)，由此建立了一種ALP的高靈敏檢測(cè)方法.該方法可用于人血清中ALP活性的檢測(cè)，為與ALP相關(guān)的疾病診斷與治療提供了理論基礎(chǔ).

Scheme 1 Proposed mechanism for ALP activity evaluation by GQDs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

GQDs（1 mg/mL）購于南京先豐納米材料科技有限公司；o-DHB，o-benzoquinone和N-乙基馬來酰亞胺（NEM）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ALP，AAP，AA，HRP，H2O2，Na3VO4，蛋白質(zhì)、氨基酸和金屬離子購自美國Sigma-Aldrich有限公司；以上試劑均為分析純，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步純化；實(shí)驗(yàn)用水均由美國Millipore-Q公司超純水系統(tǒng)純化制得（18.2 MΩ·cm）.

JEM-2011型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司）；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國Thermo Fisher Scientific公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；UV-3600 Plus型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis）和RF-6000型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；QM-8075型穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（日本堀場(chǎng)公司）；PB-21型pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）．

1.2 GQDs的表征

1.2.1 透射電子顯微鏡表征 將用超純水溶解的GQDs超聲10 min后，取10μL滴加在銅網(wǎng)超薄碳支持膜上，用紅外燈干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）測(cè)試.測(cè)試時(shí)電子的加速電壓為200 kV.

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析 將固體GQDs研磨后采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，掃描范圍4000～400 cm-1.

1.2.3 熒光光譜分析 發(fā)射光譜的測(cè)定：采用濃度為25μg/mL的GQDs溶液，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，發(fā)射光譜測(cè)量范圍為390～650 nm.激發(fā)光譜的測(cè)定：采用濃度為25μg/mL的GQDs溶液，設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)光譜測(cè)量范圍為325～425 nm.

1.2.4 絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率測(cè)定 設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射光譜范圍為390～600 nm進(jìn)行測(cè)試.絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率（QY，%）按照下式計(jì)算［27］：

式中：Lemission代表GQDs的發(fā)射光子數(shù)；Esolvent和Esample分別表示溶劑和GQDs的激發(fā)光子數(shù).

1.2.5 熒光壽命測(cè)定 利用激發(fā)光波長(zhǎng)為340 nm的脈沖光源，測(cè)定GQDs的熒光衰變曲線.GQDs的平均熒光壽命（＜τ＞，ns）按照以下公式采用雙指數(shù)擬合方式計(jì)算［28］：

式中：τi（ns）為GQDs的熒光衰減時(shí)間；bi為歸一化的指數(shù)前因子.

1.3 H2O2和AA的檢測(cè)

1.3.1 H2O2的檢測(cè) 將200μL不同濃度的H2O2，50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和600μL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合均勻，于25°C反應(yīng)30 min；然后將100μL GQDs（250μg/mL）加入混合溶液中，室溫下繼續(xù)反應(yīng)1 min.

1.3.2 AA的檢測(cè) 首先制備100 mmol/L的AA新鮮儲(chǔ)備溶液，制備后不超過4 h內(nèi)使用，以最大程度地減少空氣中的氧化.將200μL不同濃度的AA，200μL H2O2（500μmol/L），50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和400μL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合，于25°C反應(yīng)30 min；然后加入100μL GQD（250μg/mL），室溫下繼續(xù)反應(yīng)1 min.在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的熒光光譜，記錄GQDs在440 nm處的熒光強(qiáng)度用于定量分析.

1.4 ALP活性檢測(cè)

將100μL不同活性的ALP（pH=8.0）和50μL AAP（10 mmol/L）混合，在37°C水浴中反應(yīng)20 min；然后將200μL H2O2（500μmol/L），50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和450μL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合，在25°C下反應(yīng)20 min；然后將100μL的GQDs（250μg/mL）加入混合溶液中，室溫下繼續(xù)反應(yīng)1 min.在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的熒光光譜，記錄GQDs在440 nm處的熒光強(qiáng)度用于定量分析.

1.5 人血樣中ALP活性檢測(cè)

通過靜脈穿刺法獲得課題組中健康成年男性和女性志愿者的人體血液樣品，以10000 r/min轉(zhuǎn)速離心8 min后取上層清液，于-20°C儲(chǔ)存.將離心后的人血清樣品用Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH=8.0）稀釋10倍，加入0.3 mmol/L的NEM以消除實(shí)際樣品中谷胱甘肽和半胱氨酸的干擾［29］.將100μL不同濃度的預(yù)處理人血清樣品代替ALP標(biāo)準(zhǔn)溶液加入檢測(cè)體系中，其余測(cè)試步驟和條件與ALP的活性檢測(cè)相同.記錄GQDs在440 nm處的熒光強(qiáng)度用于檢測(cè)人血清樣品中ALP的活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 GQDs的表征

如圖1（A）中TEM照片所示，GQDs粒子呈近似球狀，顆粒分散性較好，無明顯聚集現(xiàn)象.圖1（A）插圖中單個(gè)GQDs粒子的HRTEM照片清晰地顯示了GQDs的晶體結(jié)構(gòu)，晶格間距為0.24 nm，歸屬于石墨（sp2）碳的（001）衍射晶面［30］.對(duì)GQDs的粒徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，如圖1（B）所示，GQDs的粒徑分布較窄且呈正態(tài)分布，粒徑主要分布在2.5～3.5 nm之間，平均粒徑為2.99 nm.

Fig.1 TEMimage(A)and size distribution(B)of GQDsInset of(A)is HRTEM image of one GQDs particle.

由GQDs的FTIR表征結(jié)果（圖2）可知，3431 cm-1處的吸收峰歸屬于O—H鍵的伸縮振動(dòng)［31，32］；2912和1383 cm-1的吸收峰分別歸屬于C—H鍵的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)［33］；1634和871 cm-1處的2個(gè)特征吸收峰分別歸屬于C=O鍵的伸縮振動(dòng)和N—H鍵的彎曲 振 動(dòng)［31，33］.FTIR結(jié) 果 表 明，GQDs表 面 富 含—COOH和—OH等含氧官能團(tuán)，致使GQDs具有良好的水溶性.

Fig.2 FTIR spectrum of GQDs

如圖3（A）中紫外-可見吸收光譜所示，GQDs在372 nm處的典型吸收峰對(duì)應(yīng)于C=O鍵的n→π*電子躍遷［34］.由熒光光譜可知，GQDs的熒光激發(fā)峰與發(fā)射峰呈現(xiàn)狹窄而對(duì)稱的特點(diǎn)，證明GQDs的粒徑大小均勻、分散性好.由圖3（A）中插圖可見，GQDs溶液在自然光下呈無色透明，但在365 nm紫外燈照射下呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光.采用積分球計(jì)算得到GQDs的絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率為14.2%.通過雙指數(shù)方程擬合得知GQDs的平均熒光壽命為（3.12±0.11）ns.

Fig.3 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of GQDs(A)and emission spectra of GQDs under different excitation wavelengths(B)Insets in（A）are photographs of GQDs under the irradiation of white light（left）and 365 nm UV lamp（right）.

由圖3（B）可知，當(dāng)GQDs的激發(fā)波長(zhǎng)從320 nm增大到410 nm時(shí)，GQDs的熒光發(fā)射波長(zhǎng)基本維持在440 nm不變，只是最大熒光發(fā)射強(qiáng)度先增大再減小.由此可知，GQDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和最佳熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為380 nm和440 nm.與大多數(shù)碳基熒光納米材料的激發(fā)波長(zhǎng)依賴性特征不同，恒定的熒光發(fā)射波長(zhǎng)表明GQDs只含有一個(gè)發(fā)射體，可有效避免自發(fā)熒光影響，提高其分析檢測(cè)的抗干擾能力和分辨率.

在實(shí)際檢測(cè)過程中，GQDs熒光探針的熒光性能受熒光持久度、離子強(qiáng)度和溶液pH影響較大.如圖4（A）所示，當(dāng)GQDs在365 nm紫外燈下連續(xù)照射180 min后，GQDs的熒光強(qiáng)度幾乎維持不變，表明GQDs具有較強(qiáng)的抗光漂白性和較好的熒光持久度.如圖4（B）所示，將NaCl的濃度從0調(diào)節(jié)到3 mol/L時(shí)，GQDs的熒光強(qiáng)度依然不變，表明GQDs在高離子濃度下能保持較好的熒光穩(wěn)定性.如圖4（C）所示，GQDs在pH=4.0～8.5范圍內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性.以上結(jié)果表明，GQDs在苛刻的條件下也具有優(yōu)異的光學(xué)穩(wěn)定性，是一種很有前途的熒光納米傳感材料.

Fig.4 Effects of irradiation time(A),NaCl concentration(B)and pH value(C)on the fluorescence intensity of GQDs

2.2 檢測(cè)機(jī)制研究

Fig.5 Fluorescence spectra of GQDs(a),GQDs/HRP(b),GQDs/o-DHB(c),GQDs/H2O2(d),GQDs/AAP(e),GQDs/ALP(f),GQDs/AA(g),GQDs/Na3VO4(h),GQDs/HRP/o-DHB(i),GQDs/HRP/H2O2/o-DHB(j),GQDs/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(k),GQDs/ALP/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(l)and GQDs/Na3VO4/ALP/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(m)

由圖5可知，單獨(dú)的HRP，o-DHB，H2O2，AAP，ALP，AA和Na3VO4對(duì)GQDs的熒光強(qiáng)度幾乎無影響（圖5中譜線b～h）.當(dāng)HRP和o-DHB共存時(shí)，無法生成o-benzoquinone，所以GQDs的熒光強(qiáng)度維持不變（圖5中曲線i）.當(dāng)HRP，H2O2和o-DHB共存時(shí)，會(huì)生成o-benzoquinone，致使GQDs在440 nm處的熒光被猝滅（圖5譜線j）.繼續(xù)加入AAP后，這種情況保持不變（圖5譜線k）.當(dāng)ALP，AAP，HRP，H2O2和o-DHB共存時(shí)，生成的還原劑AA能有效清除溶液中的H2O2和·OH，抑制o-benzoquinone的生成，使GQDs的熒光強(qiáng)度維持在其原始值附近（圖5譜線l）.當(dāng)加入ALP的抑制劑Na3VO4時(shí)，GQDs的熒光再次被猝滅（圖5譜線m），驗(yàn)證了Na3VO4對(duì)ALP活性的抑制作用.由此可知，該GQDs熒光探針可同時(shí)用于ALP的活性檢測(cè)及其抑制劑的檢測(cè).

為了揭示該檢測(cè)方法的猝滅機(jī)制，考察了單獨(dú)GQDs，H2O2/HRP/o-DHB體系和GQDs/H2O2/HRP/o-DHB體系的紫外-可見吸收光譜，以及GQDs/H2O2/HRP/o-DHB體系和單獨(dú)GQDs的紫外-可見吸收差譜.如圖6（A）所示，H2O2/HRP/o-DHB體系的吸收光譜與（GQDs/H2O2/HRP/o-DHB）-GQDs的吸收差譜無重疊，表明由H2O2/HRP/o-DHB體系生成的o-benzoquinone與GQDs形成了新的基態(tài)復(fù)合物［11，12］，初步證明了o-benzoquinone靜態(tài)猝滅GQDs熒光的作用機(jī)制.為進(jìn)一步驗(yàn)證這一作用機(jī)制，考察了H2O2/HRP/o-DHB體系對(duì)GQDs熒光壽命的影響.如圖6（B）所示，單獨(dú)GQDs的平均熒光壽命為（3.12±0.11）ns，而GQDs/H2O2/HRP/o-DHB體系的平均熒光壽命為（3.11±0.08）ns，GQDs的熒光壽命幾乎無變化，表明由H2O2/HRP/o-DHB體系生成的o-benzoquinone對(duì)GQDs的熒光壽命無影響，驗(yàn)證了o-benzoquinone靜態(tài)猝滅GQDs熒光的作用機(jī)制［11，12］.

Fig.6 UV-Vis absorption spectra of GQDs,H2O2/HRP/o-DHB,GQDs/H2O2/HRP/o-DHB and(GQDs/H2O2/HRP/o-DHB)-GQDs systems(A),fluorescence decay traces of GQDs and GQDs/H2O2/HRP/o-DHB system(B)Insets in（B）are fluorescence lifetimes data of GQDs(a)and GQDs in GQDs/H2O2/HRP/o-DHB system(b).τis the fluorescent lifetime of trypsin and b is the normalized pre-exponential factor.The average fluorescence lifetime(＜τ＞)is calculated according to the equation of＜τ＞=τibi.

2.3 H2O2和AA的檢測(cè)

GQDs熒光探針可用于H2O2和AA的檢測(cè).為達(dá)到最佳檢測(cè)效果，對(duì)相關(guān)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化.如圖7所示，在以下實(shí)驗(yàn)條件下，GQDs的相對(duì)熒光強(qiáng)度信號(hào)I/I0（I0和I分別表示加入物質(zhì)前后GQDs在440 nm處的熒光強(qiáng)度值）達(dá)到最優(yōu)值：GQDs的濃度為250μg/mL（100μL）［圖7（A）］；HRP的濃度為0.8μg/mL（50μL）［圖7（B）］；o-DHB的濃度為6 mmol/L（50μL）［圖（C）］；Tris-HCl緩沖液的pH值為6.0［圖7（D）］；反應(yīng)溫度為25℃［圖7（E）］；反應(yīng)時(shí)間為40 min［圖7（F）］.

Fig.7 Effects of GQDs amount(A),HRP amount(B),o-DHB concentration(C),pH value(D),reaction temperature(E)and reaction time(F)on the relative fluorescence intensity of GQDs-based fluorescent probe

由圖8（A）可知，當(dāng)H2O2濃度逐漸增大時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系在440 nm處的熒光強(qiáng)度不斷減弱.如圖8（B）所示，當(dāng)H2O2濃度從0增加到200μmol/L時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系的I/I0值不斷減弱.在最優(yōu)條件下，當(dāng)H2O2的濃度在0.4～100μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，I/I0值與H2O2濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I/I0=-0.0078×［H2O2］+0.971，相關(guān)系數(shù)為0.996.由公式LOD=3σ/s（其中，s為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，σ為11次空白測(cè)試得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差）計(jì)算得出H2O2的檢出限為0.318μmol/L.

Fig.8 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing concentration of H2O2(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2 from 0.4μmol/L to 100μmol/L.

由圖9（A）可知，當(dāng)AA的濃度逐漸增大時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系在440 nm處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng).如圖9（B）所示，當(dāng)AA濃度從0增加到160μmol/L時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系的I/I0值不斷增強(qiáng).在最優(yōu)條件下，當(dāng)AA的濃度在1～40μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，I/I0值與AA濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I/I0=0.0486×［AA］+1.01，相關(guān)系數(shù)為0.998.由公式LOD=3σ/s計(jì)算得出AA的檢出限為0.588μmol/L.

Fig.9 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing concentration of AA(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0)and concentration of AA(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0）and concentration of AA from 1.0μmol/L to 40μmol/L.

2.4 ALP的活性檢測(cè)

合成的GQDs熒光探針可進(jìn)行ALP活性的實(shí)時(shí)、高效檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中探索了最佳檢測(cè)條件.如圖10所示，在以下實(shí)驗(yàn)條件下，GQDs熒光探針檢測(cè)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度信號(hào)I/I0達(dá)到最優(yōu)值：Tris-HCl緩沖溶液的pH為8.0［圖10（A）］；酶反應(yīng)溫度為37℃［圖10（B）］；酶反應(yīng)時(shí)間為20 min［圖10（C）］.

Fig.10 Effects of pH value(A),enzymatic reaction temperature(B)and enzymatic reaction time(C)on the relative fluorescence intensity of GQDs-based fluorescent probe

由圖11（A）可知，當(dāng)ALP的活性逐漸增大時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系在440 nm處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng).如圖11（B）所示，當(dāng)ALP的活性從0逐漸增加到15 U/L時(shí)，GQDs熒光探針檢測(cè)體系的I/I0不斷增強(qiáng).在最優(yōu)條件下，當(dāng)ALP的活性在0.1～5 U/L范圍內(nèi)時(shí)，I/I0值與ALP活性呈良好的線性關(guān)系，并且符合線性回歸方程I/I0=0.434×［ALP］+1.04，相關(guān)系數(shù)為0.998.由公式LOD=3σ/s計(jì)算得出ALP的檢出限為0.084 U/L.

Fig.11 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing activity of ALP(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0)and activity of ALP(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0）and activity of ALP from 0.1 to 5 U/L.

在最佳檢測(cè)條件下，考察了該GQDs熒光探針檢測(cè)體系對(duì)ALP活性檢測(cè)的選擇性.如圖12所示，當(dāng)加入10倍于ALP活性的蛋白質(zhì)時(shí)［胃蛋白酶（Pep）、胰蛋白酶（TRY）、溶菌酶（Lys）、凝血酶（Thr）、人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖氧化酶（GOx）和乙酰膽堿酯酶（AchE）］，這些蛋白質(zhì)均不會(huì)影響GQDs熒光探針檢測(cè)體系的I/I0值.由此可知，該方法對(duì)ALP的活性檢測(cè)具有較好的選擇性.

Fig.12 Effects of different enzymes on the relative fluorescence intensity of GQDsbased fluorescent probea.ALP;b.blank;c.Pep;d.TRY;e.Lys;f.Thr;g.HSA;h.BSA;i.GOx;j.AchE.

在最佳檢測(cè)條件下，考察該GQDs熒光探針檢測(cè)體系對(duì)ALP活性檢測(cè)的抗干擾能力.如表1所示，常見的共存物質(zhì)，如生物小分子、氨基酸和金屬離子等，對(duì)GQDs熒光探針檢測(cè)體系熒光幾乎無影響.因此，該GQDs熒光探針檢測(cè)體系對(duì)ALP活性的檢測(cè)具有較強(qiáng)的抗干擾能力，有望用于實(shí)際樣品中ALP活性的高效檢測(cè).

據(jù)報(bào)道，成人血清樣品中ALP的活性通常為40～190 U/L［14］.根據(jù)上述所得ALP活性檢測(cè)的線性擬合回歸方程，可計(jì)算出原始人血清樣品中ALP的活性.如表2所示，在乘以稀釋因子后，用該GQDs熒光探針測(cè)得人血清中的ALP活性在87.2～145 U/L范圍內(nèi)，此結(jié)果符合報(bào)道值［14］.當(dāng)將3種不同活性的ALP（0.5，3和5 U/L）加入到溶液中時(shí)，人血清樣品中ALP活性測(cè)定的回收率在95.5%～103.7%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%～4.09%.結(jié)果表明，該GQDs熒光檢測(cè)體系能達(dá)到ALP活性檢測(cè)的要求，為實(shí)際生物樣品中ALP活性的實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了可能.

Table 1 Influences of 0.1 mmol/L co-existing substances on ALP activity evaluation

Table 2 Evaluation of ALP activity in human serum samples

如表3所示，與一些已報(bào)道的ALP活性檢測(cè)的方法相比，本文構(gòu)建的GQDs熒光探針檢測(cè)體系對(duì)ALP活性的檢測(cè)具有原材料成本低、操作簡(jiǎn)便及檢出限低等優(yōu)勢(shì).

Table 3 Evaluation of ALP activity with different methods and different probes

3 結(jié) 論

基于苯醌類物質(zhì)能靜態(tài)猝滅GQDs熒光的特性，建立了基于GQDs的熒光探針檢測(cè)體系，用于ALP活性的實(shí)時(shí)、高效檢測(cè).該方法對(duì)ALP活性的檢出限為0.084 U/L，具有良好的選擇性和較強(qiáng)的抗干擾能力，并可被用于人血清樣品中ALP活性的檢測(cè).此方法在與堿性磷酸酶相關(guān)的疾病診斷與治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景.