lncRNA HOTAIR靶向調(diào)控miR-424的表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

段麗娜，楊晶晶，蔣友琴，羅賢琳，劉杰，李穎

1遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，貴州遵義 563000；2遵義市第一人民醫(yī)院婦科，貴州遵義 563000

目前，在全球女性惡性腫瘤中卵巢癌的發(fā)病率和死亡率均位居第四[1]。2017年，全球新發(fā)卵巢癌約42.8萬(wàn)例，死亡23.2萬(wàn)例[2]。發(fā)展中國(guó)家的卵巢癌發(fā)病率仍處于較高水平，其中85%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期(階段Ⅱ-Ⅲ)，在階段Ⅲ的高達(dá)60%[3-4]。卵巢癌進(jìn)展至晚期或復(fù)發(fā)后，其預(yù)后相對(duì)較差。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類影響腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。lncRNA存在于人體體液中，是常用的診斷生物標(biāo)志物[6-7]。然而，目前尚不清楚lncRNA是否為卵巢癌診斷及治療的有效生物標(biāo)志物。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是由位于染色體12q13.13上的人HOXC基因座表達(dá)翻譯的核苷酸分子組成，可將多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)募集到特定的HOXC基因座靶基因上，產(chǎn)生表觀遺傳沉默轉(zhuǎn)移抑制的效果[8-9]。晚期卵巢癌中存在HOTAIR表達(dá)水平的異常增高[10]，且HOTAIR是卵巢癌患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及晚期死亡的危險(xiǎn)因素之一[11]。miR-424被認(rèn)為是胃癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的調(diào)控因子[12]。因此，探討miR-424與HOTAIR在卵巢癌生物學(xué)行為中的作用具有重要意義。

本研究檢測(cè)了卵巢癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平，分析HOTAIR表達(dá)水平與卵巢癌患者總體存活時(shí)間的關(guān)系，以及調(diào)節(jié)下游miRNA表達(dá)活性對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲的影響，旨在探討HOTAIR在卵巢癌患者中的生物學(xué)表達(dá)特性，進(jìn)而分析其未來(lái)應(yīng)用于臨床的可能。

1 材料與方法

1.1組織細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 收集2018年1－6月在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院接受卵巢癌手術(shù)的60例患者的卵巢癌(n=60)及隨機(jī)配對(duì)卵巢良性腫瘤組織(n=60)樣本。所有患者均簽署知情同意書(shū)，且本研究已獲得遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，保存于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。4～6周齡BALB/c雌性裸鼠12只，SPF級(jí)，體重(17.5±2.0) g，購(gòu)自遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(貴)2014-0038]，于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)[使用許可證：SYXK(貴)2014-0165]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 將A2780卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)構(gòu)建的siRNAHOTAIR(si-HOTAIR)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，將轉(zhuǎn)染siRNA-NC(si-NC)的A2780細(xì)胞作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為敲除HOTAIR基因組的細(xì)胞，對(duì)照組為未敲除HOTAIR基因組的細(xì)胞。

1.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 分別提取卵巢癌及配對(duì)卵巢良性腫瘤組織中的總RNA。采用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA有義鏈。然后在qRTPCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s、60 ℃退火32 s；循環(huán)50次后檢測(cè)其熔解曲線。分析各樣本Ct值，采用2–ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。HOTAIR引物：正向5'-GTGGCTAU CTAATCTAGTCGAGCAAACT-3'，反向5'-CCTAT GTTCTGATGCGGCAGTGCAAAGT-3'；miR-424引物：正向5'-TTGAGCTATCTAAGTTAGCTGACAAT CG-3'，反向5'-GCCTAGCTGAGCTACUAAGGGCG AGCA-3'。

1.4雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-424熒光素酶活性將野生型(WT)及突變型(MUT)的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A2780卵巢癌細(xì)胞中，分別命名為野生型miR-424、突變型miR-424，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定其熒光素酶活性情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。野生型miR-424引物：正向5'-GCATGCTAGCTACGGCGG AAAAGCTACT-3'，反向5'-ATGCTAGCTAGGGACG GCCAGCACCTATC-3'；突變型miR-424引物：正向5'-TCTGATGCTGATGCTAGCGATCGAAA-3'，反向5'-GGATGCGGAAACTGAGCTAAAGCGAA-3'。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR對(duì)細(xì)胞遷移行為的影響 使用200 μl無(wú)菌移液器尖端以標(biāo)準(zhǔn)方式將單層細(xì)胞劃傷，創(chuàng)建無(wú)細(xì)胞區(qū)域。將培養(yǎng)基吸出并使用干凈沖洗液沖洗后，再用新鮮的完全培養(yǎng)基在37 ℃條件下繼續(xù)孵育24 h。24 h后記錄并拍照細(xì)胞遷移情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR對(duì)細(xì)胞侵襲行為的影響 將1×105個(gè)細(xì)胞懸浮于200 μl無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后接種到上室中。在下室中添加含有胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，除去小室頂部表面上的細(xì)胞。底部表面上的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)入侵細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOTAIR對(duì)細(xì)胞凋亡行為的影響 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔板中。24 h后用siRNA-HOTAIR(si-HOTAIR)進(jìn)一步處理細(xì)胞48 h，然后用膜聯(lián)蛋白和碘化丙啶染色，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR對(duì)動(dòng)物體內(nèi)成瘤的影響 將4～6周齡裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。將1×106個(gè)si-HOTAIR細(xì)胞和si-NC細(xì)胞分別注射至實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠的下腹部皮下區(qū)域。8周后檢測(cè)裸鼠腫瘤異種移植物的體積及生長(zhǎng)情況。移植物大小根據(jù)以下公式計(jì)算：腫瘤體積=1/2(最短直徑)2×最長(zhǎng)直徑。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；HOTAIR與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用Pearson'sχ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HOTAIR在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及生存率分析 qRT-PCR結(jié)果顯示，卵巢癌組織中HOTAIR mRNA表達(dá)水平明顯高于良性卵巢腫瘤組織(58.64±6.32vs. 6.35±0.02，t=11.09，P＜0.05)。對(duì)60例卵巢癌患者的生存曲線分析結(jié)果顯示，HOTAIR高表達(dá)患者的遠(yuǎn)期生存率低于低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 不同HOTAIR表達(dá)水平患者的生存率分析Fig.1 Expression of HOTAIR in ovarian cancer and analysis of survival rate

2.2HOTAIR與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 不同年齡段的卵巢癌患者HOTAIR表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.70，P＞0.05)；隨著卵巢癌病理分期增高，卵巢癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平明顯升高(χ2=11.64，P＜0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者卵巢癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.23，P＜0.05)(表1)。

表1 卵巢癌組織中HOTAIR表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系Fig.1 Relationship of the expression of HOTAIR to the clinicopathological features in tissues of patients with ovarian cancer

2.3雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR與miR-424的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具(Targetscan)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HOTAIR存在與miR-424相互關(guān)聯(lián)的可能，兩者有較為相似的結(jié)合序列(圖2A)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組可抑制野生型miR-424的熒光素酶活性(0.42±0.08vs.1.06±0.11，t=11.38，P＜0.05，圖2B)，而對(duì)突變型miR-424的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(1.04±0.10vs.1.05±0.08，t=11.38，P＜0.05，圖2B)。

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR與miR-424之間的相互關(guān)系Fig.2 Dual luciferase assay to detect the relationship between HOTAIR and miR-424

2.4HOTAIR表達(dá)對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24 h的遷移距離明顯短于對(duì)照組[(21.21±3.08) μmvs.(92.34±8.65) μm，t=12.34，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響(×40)Fig.3 Effect of HOTAIR on migration ability of ovarian cancer cells detected by scratch test (×40)圖中標(biāo)記為測(cè)量寬度

2.5HOTAIR表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲行為的影響結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞侵襲率明顯低于對(duì)照組(28.63%±5.59%vs. 275.36%±21.62%，P＜0.05，圖4)。

圖4 HOTAIR對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲行為的影響(結(jié)晶紫染色，×40)Fig.4 Effect of HOTAIR on the invasion behavior of ovarian cancer cells (Crystal violet staining, ×40)

2.6HOTAIR表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡行為的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(30.2%±2.12%vs. 7.31%±2.01%，t=10.64，P＜0.05，圖5)。

圖5 HOTAIR對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of HOTAIR on the apoptosis of ovarian cancer cells

2.7HOTAIR對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)組裸鼠體內(nèi)腫瘤的直徑及數(shù)目均小于對(duì)照組，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植瘤的腫瘤體積[(0.85±0.06) cm3vs. (3.05±0.28) cm3，t=13.41，P＜0.05]及重量[(1.12±0.08) gvs. (2.91±0.19) g，t=11.64，P＜0.05]均明顯降低(圖6)。

圖6 HOTAIR對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤體積及重量的影響Fig.6 Effect of HOTAIR on the growth of transplanted tumors in nude mice

3 討 論

除研究卵巢癌的新型診斷標(biāo)志物以外，進(jìn)一步了解卵巢癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更有針對(duì)性、更有效的治療方法至關(guān)重要[13-14]。lncRNA HOTAIR在卵巢癌過(guò)表達(dá)或修飾的各種基因和蛋白中發(fā)揮重要調(diào)控作用[15-16]。本研究分析了卵巢癌患者、卵巢癌細(xì)胞系及小鼠異種移植模型中HOTAIR表達(dá)的意義，結(jié)果顯示，與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤中HOTAIR表達(dá)水平更高，提示高HOTAIR表達(dá)狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素，HOTAIR可能在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。然而，本研究存在一些局限性：樣本量相對(duì)較少；僅使用皮下異種移植模型來(lái)研究癌細(xì)胞的體內(nèi)行為，與腹膜內(nèi)移植腫瘤實(shí)驗(yàn)相比誤差大(皮下植入的癌細(xì)胞允許快速和定量的腫瘤形成，更適合用于連續(xù)測(cè)量腫瘤的研究，而使用腹膜內(nèi)和原位異種移植模型定量監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)本質(zhì)上可代表更逼真的腫瘤微環(huán)境)[17-18]。

本研究按患者年齡、病理分期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)不同年齡段的卵巢癌患者HOTAIR表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HOTAIR表達(dá)情況與病理分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，HOTAIR在細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤侵襲、癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用[19-21]。本研究探討了HOTAIR的潛在作用，與之前對(duì)臨床卵巢癌標(biāo)本的分析結(jié)果一致[8,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制HOTAIR表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力受到抑制，且細(xì)胞凋亡能力相對(duì)增強(qiáng)。此外，HOTAIR的表達(dá)與體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力呈正相關(guān)，且與小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)呈正相關(guān)，提示HOTAIR是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵lncRNA之一，有望為臨床卵巢癌靶向治療策略的制定提供了參考。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，HOTAIR可為確定卵巢癌患者的臨床病理學(xué)階段及預(yù)后判斷提供參考。此外，HOTAIR可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)活性影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲能力，可能是一種潛在的治療靶點(diǎn)，有望為卵巢癌的治療提供幫助。