小分子化合物對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)制性衰老的逆轉(zhuǎn)作用

黎彥，冀帥飛，付小兵，項(xiàng)江兵，陳華婷，劉藝瓊，周來(lái)顯，孫曉艷，吳旭

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸外科，廣州 510515

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有強(qiáng)大自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。MSCs具有其他成體干細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，包括來(lái)源廣泛、取材容易[2]、分離操作簡(jiǎn)單、免疫原性低、倫理爭(zhēng)議少等，因此以其為基礎(chǔ)的干細(xì)胞療法近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，為治療各種難治性疾病帶來(lái)了新的契機(jī)[3-5]。能夠獲得足夠“數(shù)量”和“質(zhì)量”的干細(xì)胞，是MSCs作為干細(xì)胞藥物應(yīng)用于臨床規(guī)?；委煹那疤釛l件。但大量基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，MSCs的生物學(xué)屬性(如植入性、分化潛能、免疫調(diào)節(jié)活性及歸巢能力等)發(fā)生了顯著改變，增加了制備批次間和療效的不確定性，特別是隨著體外傳代次數(shù)的遞增，胞內(nèi)積累的DNA復(fù)制壓力和染色體縮合缺陷可引發(fā)染色體高頻畸變[6]，增加了MSCs產(chǎn)品臨床輸注的潛在風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，在體外培養(yǎng)體系中延緩或逆轉(zhuǎn)MSCs的衰老進(jìn)程，并維持MSCs的原始生物學(xué)特性，將有助于進(jìn)一步開發(fā)和完善MSCs的制備工藝，改善MSCs的臨床治療效果?；谛》肿踊衔锏恼T導(dǎo)重編程是近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[8]，特別是小分子化合物因靶點(diǎn)清晰、便于定量、作用相對(duì)可控，被廣泛應(yīng)用于對(duì)體細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控及功能干預(yù)方面的研究[9]。鑒于小分子化合物在體細(xì)胞重編程過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)，本課題組提出通過(guò)靶向干性相關(guān)的信號(hào)通路篩選獲得異性的小分子化合物組合，以作用于老化的MSCs，逆轉(zhuǎn)其衰老進(jìn)程，使其在體外重新獲得可與年輕MSCs相媲美的生物學(xué)特性。本研究探索小分子全化學(xué)培養(yǎng)體系在延緩MSCs衰老進(jìn)程、維持MSCs固有屬性中的作用，以期為優(yōu)化MSCs的生產(chǎn)工藝、保證臨床級(jí)干細(xì)胞制備過(guò)程中MSCs的質(zhì)量及其臨床應(yīng)用效果提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 丙戊酸、Repsox購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)購(gòu)自美國(guó)SouthernBiotech公司；Ki-67、OCT4、Nanog、P16、P21鼠單克隆抗體及Alex Fluor-594標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；DyLightTM488-鬼筆環(huán)肽(phalloidin)購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色試劑盒、山羊血清、4%多聚甲醛、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；OCT4、Nanog、P16、P21引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。激光共聚焦顯微鏡、光學(xué)顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leica公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2復(fù)制性衰老細(xì)胞模型的建立及小分子處理人臍帶MSCs由本實(shí)驗(yàn)室保存。年輕MSCs在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳至20代(P20)，建立復(fù)制性衰老細(xì)胞模型(P20-MSCs)。將細(xì)胞密度為50%～60%的衰老MSCs隨機(jī)分為小分子處理組(SP20-MSC)與衰老模型組(P20-MSC)。小分子處理組于含丙戊酸(500 μmol/L)、Repsox(10 μmol/L)、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12全化學(xué)培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，衰老模型組繼續(xù)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次全新培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取第5代臍帶MSCs(P5-MSC)作為對(duì)照組。

1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取各組細(xì)胞各一皿，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4SA-β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老程度 取各組細(xì)胞分別鋪于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，用細(xì)胞固定液固定15 min，按照SA-β-GAL染色試劑盒說(shuō)明書配制染色液，每孔加入2 ml染色液，置于37 ℃、無(wú)CO2環(huán)境中孵育過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。各組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，取平均值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 各組取1×106個(gè)細(xì)胞重懸于1 ml PBS中，加入50 μmol/L細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑作用20 min，300×g離心5 min，取細(xì)胞沉淀重懸于100 μl流式上樣緩沖液(含0.5% BSA的PBS)中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，加入5 μl Annexin V-FITC室溫孵育10 min，再加入5 μl PI室溫孵育5 min，補(bǔ)充上樣緩沖液至400 μl，30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6免疫熒光染色觀察細(xì)胞中Ki-67、OCT4、Nanog、P21、P16蛋白的表達(dá)情況 取小分子處理組與衰老模型組細(xì)胞，分別鋪于共聚焦皿中，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，加入0.2% Triton X-100室溫通透20 min，加入5%山羊血清封閉30 min，加入一抗Ki-67(1:200)、OCT4(1:200)、Nanog(1:200)、P21(1:200)、P16(1:200)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，加入phalloidin孵育20 min，DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下拍照觀察，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)OCT4、Nanog、P21、P16 mRNA的表達(dá)水平 取小分子處理組與衰老模型組細(xì)胞，提取總RNA，根據(jù)天根cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板行RT-qPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔鏈分析。反應(yīng)結(jié)束后取Ct值，以β-actin為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組細(xì)胞鋪在6孔板中，小分子處理組于添加小分子的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)照組和衰老模型組于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至100%時(shí)，用10 μg/ml絲裂霉素C處理1 h，然后用1000 μl槍頭在6孔板中垂直劃痕；PBS洗滌1次，清除劃痕周圍細(xì)胞團(tuán)塊，加入2 ml相應(yīng)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后觀察劃痕愈合情況，計(jì)算劃痕愈合百分比。

1.9Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中；用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，取10 000個(gè)細(xì)胞接種于Transwell上室中，補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基至250 μl；下室中加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)；6 h后取出上室，用2 ml PBS洗滌2次；浸入4%多聚甲醛溶液中固定30 min；PBS洗滌2次，加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min；PBS洗滌3～5次，直至無(wú)紫色液體，顯微鏡下觀察上室透膜細(xì)胞染色情況，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.10克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，重懸于培養(yǎng)基中；用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，取5000個(gè)細(xì)胞，混勻于2 ml DMEM/F12培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)中，均勻鋪于100 mm皿中，置于37.5 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2周，期間按時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS洗滌2次，加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min；PBS洗滌3～5次，直至無(wú)紫色液體，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1小分子化合物對(duì)MSCs形態(tài)的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，對(duì)照組細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形；衰老模型組細(xì)胞體積增大、邊界模糊，細(xì)胞形態(tài)由梭形或不規(guī)則三角形逐漸變?yōu)楸馄綘?，胞質(zhì)呈現(xiàn)凸起增多現(xiàn)象；小分子處理組細(xì)胞凸起減少，形態(tài)為梭形及不規(guī)則三角形，少數(shù)呈橢圓狀(圖1)。

圖1 顯微鏡下觀察小分子化合物對(duì)MSCs形態(tài)的影響Fig.1 Effects of small molecule compounds on the morphology of MSCs

2.2小分子化合物對(duì)MSCs衰老的影響 SA-β-gal染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性率依次為2.23%±1.00%、84.80%±1.50%、45.00%±1.23%。與對(duì)照組比較，衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；與衰老模型組比較，小分子處理組細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖2)。

圖2 小分子化合物對(duì)MSCs衰老的影響(SA-β-gal染色)Fig.2 Effects of small molecule compounds on the senescence of MSCs (β-galactosidase staining)

2.3小分子化合物對(duì)MSCs凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞凋亡率依次為5.96%±0.80%、31.40%±0.80%、21.60%±1.20%。與對(duì)照組比較，衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小分子化合物對(duì)MSCs凋亡的影響Fig.3 Effects of small molecule compounds on the apoptosis of MSCs (Flow cytometry)

2.4小分子化合物對(duì)MSCs增殖的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，小分子處理組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比高于衰老模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(89.00%±1.50%vs. 25.00%±2.00%，P＜0.001，圖4)。

圖4 小分子化合物對(duì)MSCs增殖的影響(免疫熒光染色)Fig.4 Effects of small molecule compounds on the proliferation of MSCs (Immunofluorescence staining)

2.5小分子化合物對(duì)MSCs衰老相關(guān)基因mRNA和蛋白以及干性相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，小分子處理組中P16、P21 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于衰老模型組(P16：69.00%±6.20%vs. 100.00%±12.00%，P＜0.05；P21：55.00%±7.00%vs. 100.00%±20.00%，P＜0.05)，OCT4、Nanog mRNA的相對(duì)表達(dá)量較衰老模型組分別上調(diào)3.30±0.23、5.20±0.97倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，圖5)。

圖5 小分子化合物對(duì)MSCs衰老相關(guān)基因P16、P21及干性相關(guān)基因OCT4、Nanog mRNA表達(dá)的影響(RT-qPCR)Fig.5 Effects of small molecule compounds on the mRNA expressions of cellular senescence genes P16, P21 and cell stem genes OCT4, Nanog of MSCs

免疫熒光染色結(jié)果顯示，小分子處理組中P16、P21陽(yáng)性細(xì)胞百分比均低于衰老模型組(P16：64.00%±3.20%vs. 98.00%±1.50%，P＜0.05；P21：45.00%±1.10%vs. 82.00%±2.00%，P＜0.05，圖6A、B)，OCT4、Nanog陽(yáng)性細(xì)胞百分比均高于衰老模型組(OCT4：88.40%±0.80%vs. 25.40%±1.20%，P＜0.001；Nanog：76.30%±1.70%vs. 10.50%±0.60%，P＜0.001，圖6C、D)。

圖6 小分子化合物對(duì)MSCs衰老相關(guān)蛋白P16、P21及干性相關(guān)蛋白OCT4、Nanog表達(dá)的影響(免疫熒光染色)Fig.6 Effects of small molecule compounds on the expressions of cellular senescence proteins P16, P21 and cell stem proteins OCT4, Nanog of MSCs (Immunofluorescence staining)

2.6小分子化合物對(duì)MSCs遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、衰老模型組及小分子處理組24 h劃痕愈合百分比依次為58.10%±5.45%、30.60%±4.40%、49.30%±3.30%。與對(duì)照組比較，衰老模型組24 h劃痕愈合百分比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組24 h劃痕愈合百分比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖7)。

圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小分子化合物對(duì)MSCs遷移能力的影響Fig.7 Effects of small molecule compounds on cell migration ability of MSCs detected by migration experiment

2.7小分子化合物對(duì)MSCs侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、衰老模型組及小分子處理組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(140.00±17.00)個(gè)、(34.00±9.00)個(gè)、(90.00±12.00)個(gè)。與對(duì)照組比較，衰老模型組及小分子處理組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組侵襲細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖8)。

圖8 小分子化合物對(duì)MSCs侵襲能力的影響(Transwell)Fig.8 Effects of small molecule compounds on cell invasion ability of MSCs (Transwell)

2.8小分子化合物對(duì)MSCs克隆形成能力的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞集落數(shù)依次為(247.00±20.00)個(gè)、(68.00±7.00)個(gè)、(144.00±10.00)個(gè)。與對(duì)照組比較，衰老模型組及小分子處理組細(xì)胞集落數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組細(xì)胞集落數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖9)。

圖9 小分子化合物對(duì)MSCs克隆形成能力的影響Fig.9 Effects of small molecules on the clone forming ability of MSCs

3 討 論

本研究采用一種安全、有效的方法在體外抑制并逆轉(zhuǎn)MSCs的衰老進(jìn)程，維持MSCs的固有生物學(xué)特征，結(jié)果顯示，構(gòu)建的含小分子丙戊酸、Repsox的全化學(xué)培養(yǎng)體系可下調(diào)衰老細(xì)胞中SA-β-gal的表達(dá)，降低衰老細(xì)胞中P16、P21的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)衰老細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成能力，同時(shí)抑制老化MSCs的程序性凋亡，提示小分子化合物作用于衰老MSCs能夠促使細(xì)胞向年輕狀態(tài)轉(zhuǎn)化。

MSCs是再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究中重要的種子來(lái)源細(xì)胞之一，也是少數(shù)被準(zhǔn)許應(yīng)用于臨床治療的成體干細(xì)胞之一，其安全性已得到廣泛驗(yàn)證。ClinicalTrials網(wǎng)站上注冊(cè)的與MSCs相關(guān)的臨床試驗(yàn)已經(jīng)超過(guò)1050項(xiàng)，已有10種基于MSCs的干細(xì)胞類藥物獲批上市，并在臨床應(yīng)用于多種疾病的治療，如促進(jìn)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的愈合[10]、緩解重癥急性呼吸窘迫綜合征的癥狀[11]等。但不同體系與批次分離獲得的MSCs在固有表征和分化潛能方面不同，難以滿足大規(guī)模臨床治療對(duì)細(xì)胞質(zhì)量的要求。因此，篩選靶向干性相關(guān)信號(hào)通路的小分子組合，建立全化學(xué)誘導(dǎo)體系，在提供穩(wěn)定、均一、優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞的同時(shí)，逐步替代外源性基因的表達(dá)，可從根本上解決MSCs臨床應(yīng)用中的安全性和效率問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn)，含有Repsox的小分子組合能啟動(dòng)體細(xì)胞重編程，成功將成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Repsox作為一種選擇性TGF-β通路抑制劑，具有促進(jìn)MSCs增殖、維持MSCs生物學(xué)特性的作用[13]。Zhou等[14]使用丙戊酸配合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)出了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，其原理可能是由于丙戊酸提升了胞內(nèi)組蛋白乙酰化的水平，從而幫助染色體解離，進(jìn)而提升了重編程的效果[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在使用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)的培養(yǎng)體系下，經(jīng)過(guò)15～20代次的培養(yǎng)，80%以上的細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性，表明此時(shí)絕大部分細(xì)胞開始衰老，細(xì)胞形態(tài)也從長(zhǎng)梭形變?yōu)閿傞_狀，細(xì)胞質(zhì)凸起，細(xì)胞增殖能力減弱。在種植密度為50%的情況下，年輕細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d即長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，衰老細(xì)胞則需要7～10 d才可長(zhǎng)滿；衰老細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯下降，且伴隨部分細(xì)胞凋亡。

在相同的培養(yǎng)體系下，加入丙戊酸(500 μmol/L)和Repsox (10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞形態(tài)即出現(xiàn)明顯變化，從攤開狀變?yōu)闄E圓形，且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞集落，表明細(xì)胞的克隆能力增強(qiáng)，與后續(xù)克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合(圖9)。本研究檢測(cè)小分子處理組、衰老模型組細(xì)胞衰老相關(guān)及干性相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)小分子處理后，衰老相關(guān)基因P16和P21 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)，與SA-β-gal染色結(jié)果相吻合，而干性相關(guān)基因OCT4和Nanog mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，MSCs的增殖能力、遷移能力、侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減弱。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，構(gòu)建的小分子全化學(xué)培養(yǎng)體系(含丙戊酸500 μmol/L和Repsox 10 μmol/L)能夠抑制并部分逆轉(zhuǎn)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的MSCs的衰老進(jìn)程。本研究借助小分子化合物，采用純化學(xué)手段在體外抑制并逆轉(zhuǎn)了MSCs的復(fù)制性衰老進(jìn)程，避免了使用外源性基因出現(xiàn)的不可控風(fēng)險(xiǎn)，且小分子來(lái)源普遍，效果可靠，作用明確，是維持MSCs生物學(xué)屬性良好的添加劑，有助于維持體外培養(yǎng)的MSCs的各項(xiàng)功能，為MSCs的科學(xué)研究與臨床應(yīng)用對(duì)接提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物組合對(duì)MSCs復(fù)制性衰老具有逆轉(zhuǎn)作用，且小分子Repsox及丙戊酸的作用靶點(diǎn)清晰，但這兩種小分子逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老的作用機(jī)制尚有待深入研究，且在體外培養(yǎng)條件下，導(dǎo)致細(xì)胞衰老的因素較多，如氧化應(yīng)激、高糖等，復(fù)制性衰老僅為其中一種，小分子化合物是否對(duì)其他原因?qū)е碌募?xì)胞衰老有效尚需進(jìn)一步研究。