餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷及微生物群落研究

寧祉愷，劉帥，黃元宸，劉德啟 (.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部及蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 252；2. 蘇州工業(yè)園區(qū)清源華衍水務(wù)有限公司，江蘇 蘇州 2500；.蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 252；4.華衍環(huán)境產(chǎn)業(yè)發(fā)展(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 252)

0 引言

隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，餐廚垃圾產(chǎn)生量與日俱增，因其中富含碳水化合物、油脂、蛋白質(zhì)及水分，又具有顯著的易腐發(fā)臭特點(diǎn)。因此，餐廚垃圾已成為目前一種新的環(huán)境污染源并引起廣泛的社會(huì)關(guān)注。其中厭氧發(fā)酵處理亦成為其資源化、無害化與減量化的主要途徑。近年來，通過添加組分對(duì)厭氧反應(yīng)器發(fā)酵體系C/N比及微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控受到重視并成為研究的熱點(diǎn)。研究人員以餐廚垃圾和秸稈按比例混合后為連續(xù)高溫共發(fā)酵基質(zhì)，開展了55 d長期試驗(yàn)，通過控制水力停留時(shí)間(HRT)及有機(jī)負(fù)荷(OLR)探討反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)定性及微生物群落組成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HRT降至0.5 d時(shí)，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)器中微生物流失，即使pH值穩(wěn)定在7.0左右，未出現(xiàn)VFA累積，反應(yīng)器幾乎停止產(chǎn)氣，揮發(fā)性固體去除率也僅為5.77%。高通量測試結(jié)果表明，此時(shí)體系內(nèi)梭菌目(Clostridiales)等能與產(chǎn)甲烷菌共生的水解酸化細(xì)菌的比例增加近1倍，但嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌降至0.6%。顯然，厭氧反應(yīng)器中的微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境條件緊密關(guān)聯(lián)，由于不同菌群的世代更替周期存在顯著差異，因此厭氧生物反應(yīng)器操作條件的變化會(huì)引起微生物種群的演替，進(jìn)而導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)的自適應(yīng)性重整。

本文以從蘇州某區(qū)學(xué)校、餐飲、企業(yè)、醫(yī)院、快餐等集中收集的餐廚垃圾為處理對(duì)象，利用公司附屬污水廠的厭氧污泥為協(xié)同發(fā)酵體，探討厭氧污泥添加量對(duì)餐廚垃圾高溫厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣速率、產(chǎn)氣量及組分變化的影響；利用16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)探討反應(yīng)器運(yùn)行68 d后穩(wěn)定產(chǎn)甲烷的微生物群落結(jié)構(gòu)，并與接種污泥微生物群落結(jié)構(gòu)為對(duì)照，識(shí)別其建群種與優(yōu)勢種微生物。旨在利用厭氧消化技術(shù)實(shí)現(xiàn)園區(qū)餐廚垃圾的資源最大化、過程清潔化的可行性，以期為該區(qū)餐廚垃圾的厭氧發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)、運(yùn)行過程風(fēng)險(xiǎn)管控與應(yīng)急處置提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、裝置與實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)用餐廚垃圾樣品采自公司從園區(qū)集中收集的餐廚垃圾，剔除其中雜質(zhì)如塑料袋、方便筷等，用粉碎機(jī)勻漿，過10目篩子后裝入自封袋放入冰箱中在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。接種泥為公司污水處理廠的典型厭氧污泥，收集后置于4 ℃下保存?zhèn)溆肹1]。

實(shí)驗(yàn)裝置主要由恒溫?cái)嚢璋l(fā)酵裝置及集氣裝置構(gòu)成，用橡膠管連接。實(shí)驗(yàn)前檢測氣密性，并按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃裝入實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)運(yùn)行68 d。

實(shí)驗(yàn)按餐廚垃圾與接種污泥的不同比例(折干基)采用5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4及0∶5 單獨(dú)及協(xié)同發(fā)酵連續(xù)實(shí)驗(yàn)；6個(gè)反應(yīng)器的固體含量均為8%，每天定時(shí)向反應(yīng)器中加入7.5 g基質(zhì)。協(xié)同消化實(shí)驗(yàn)的接種泥量均為150 mL，HRT為20 d，OLR揮發(fā)性固體(VS)為4 kg/(m3·d)。每天定時(shí)記錄產(chǎn)氣量并檢測收集氣體組分；定期取樣監(jiān)測反應(yīng)器中發(fā)酵液的相關(guān)理化指標(biāo)。

1.2 反應(yīng)液測定指標(biāo)及分析方法

總固體含量(TS)及VS測定方法參見GB/T 14415—2007及GB/T 5009.4—1985；脂質(zhì)采用索氏提取法，參見GB/T 14772—2008；揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)采用滴定法，參見Q/YZJ 10-03-02—2000；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定；COD采用重鉻酸鹽法，參照GB 11914—1989；C、H、N元素含量測定采用Perkin Elmer 2400II元素分析儀。

1.3 反應(yīng)器氣相組分及測定方法

6個(gè)反應(yīng)器產(chǎn)生氣體的組分分析，采用 POLI MP400S (mPower Electronics Inc.)及Multi RAE 2 (RAE Systems, USA)對(duì)收集瓶中氣體進(jìn)行組分分析[2]。

1.4 高通量測序及分析

高通量測序：將收集的待測樣品送往蘇州金唯智生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測序平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測序。利用金唯智自主研發(fā)的引物體系有效擴(kuò)增出16S rDNA的多個(gè)可變區(qū)，能夠準(zhǔn)確鑒定出包含古生菌在內(nèi)的多個(gè)物種。

多樣性分析：利用Usearch軟件平臺(tái)(http://drive5.com/uparse/，V7.0)，將測得的序列按照彼此間97%的相似性進(jìn)行劃分得到OTU；選擇97%相似度OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算，采用覆蓋度(Coverage)反映微生物物種的覆蓋率；采用香農(nóng)(Shannon)指數(shù)等反映物種的多樣性；采用Chao1指數(shù)反映群落的豐富度[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)餐廚垃圾單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

先進(jìn)行餐廚垃圾單獨(dú)靜態(tài)發(fā)酵，設(shè)置5個(gè)溫度范圍，分別為15、25、35、45及55 ℃，探討園區(qū)餐廚垃圾發(fā)酵潛力及適合的發(fā)酵溫度。溫度為15、25、35、45、55 ℃時(shí)，反應(yīng)器的平均產(chǎn)氣速率分別為10、145、325、380及560 mL/(g·d)。顯然，反應(yīng)器厭氧發(fā)酵溫度為55 ℃時(shí)的平均產(chǎn)氣速率最高，因此，將55 ℃設(shè)置為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵溫度[4]。

同時(shí)，進(jìn)一步分析了55 ℃靜態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器中發(fā)酵液COD與產(chǎn)氣量隨時(shí)間變化規(guī)律，結(jié)果如圖1所示。圖1(a)中餐廚垃圾單獨(dú)發(fā)酵在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)過濾液的COD為58 000 mg/L，逐漸上升到第6天時(shí)的70 000 mg/L，表明這段時(shí)間反應(yīng)器中的餐廚垃圾勻漿顆粒在微生物酶催化下發(fā)生了水解，產(chǎn)生小分子有機(jī)酸導(dǎo)致反應(yīng)體系 pH 值的下降。其中pH從第18天的5.7，迅速上升到第24天時(shí)的7.5，其后發(fā)酵液的pH維持在7.0～8.1之間。由此推測反應(yīng)體系中嗜酸微生物種群的增加可能會(huì)加速產(chǎn)甲烷的速率。第36天后COD呈逐日下降趨勢，第66天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)COD為20 000 mg/L，去除率達(dá)到63.2%。如此同時(shí)，反應(yīng)器在整個(gè)反應(yīng)期間出現(xiàn)4個(gè)產(chǎn)氣峰值平臺(tái)，這基本對(duì)應(yīng)發(fā)酵體系COD出現(xiàn)顯著變化的時(shí)間。因此，反應(yīng)物及其產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)性初步反映了微生物生化反應(yīng)過程，相鄰平臺(tái)期持續(xù)的時(shí)間則可能預(yù)示維持該反應(yīng)的微生物群落結(jié)構(gòu)的建群時(shí)間，表明相關(guān)微生物群落中優(yōu)勢種的形成、更替與基因繼承[5]。

此外，圖1(b)中厭氧污泥單獨(dú)高溫發(fā)酵雖然出現(xiàn)了COD濃度的波動(dòng)，但前6天的變化規(guī)律則與餐廚垃圾單獨(dú)發(fā)酵相反，產(chǎn)氣積累量低且隨時(shí)間未出現(xiàn)圖1(a)中餐廚發(fā)酵的4個(gè)產(chǎn)氣平臺(tái)期。表明厭氧污泥的單獨(dú)高溫發(fā)酵只是原微生物群落無基質(zhì)高溫淘汰與選擇及再馴化、培養(yǎng)的結(jié)果，最后僅是新建微生物群落的內(nèi)源呼吸與代謝。

2.2 餐廚垃圾單獨(dú)高溫發(fā)酵的產(chǎn)氣組分分析

實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定了餐廚垃圾單獨(dú)高溫(55 ℃)發(fā)酵產(chǎn)生氣體的組分濃度(表1)，結(jié)果表明反應(yīng)器第一及二產(chǎn)氣平臺(tái)期氣體主組分以CO2、CH4、H2及H2S為主；第三產(chǎn)氣平臺(tái)期氣體主組分以CH4、CO2、H2S及H2為主；第四產(chǎn)氣平臺(tái)期氣體主組分以CH4、CO2、H2S為主，甲烷產(chǎn)量為最高，占50%～58%左右，H2則越來越少；整個(gè)反應(yīng)過程均伴隨少量組分CO、NH3(g)及NO(g)等。這些氣相生成物是反應(yīng)器微生物生化反應(yīng)及微生物利用基質(zhì)代謝的結(jié)果，因此，各階段生成的氣體主組分則如實(shí)的記錄了主反應(yīng)過程，以及與其相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)及共生關(guān)系。第一、二產(chǎn)氣平臺(tái)期CO2及CH4氣體占比最高，并處于相對(duì)較低的pH階段，說明以產(chǎn)酸為主的微生物代謝餐廚垃圾中淀粉和纖維素等大分子碳水化合物生成小分子單糖、繼而轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸等的主要路徑，并伴隨產(chǎn)H2的過程；這也符合發(fā)酵產(chǎn)氫的最優(yōu)條件。

表1 園區(qū)餐廚垃圾在不同發(fā)酵階段氣相組分的平均濃度 單位：mg/m3

整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)生的氣相含氮副產(chǎn)物(NH3(g)及NOx(g))表明互營單胞菌的存在，因其是極端氨濃度下生物基質(zhì)厭氧消化中的關(guān)鍵微生物，主要消耗揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生甲烷。此外，第一階段H2最大產(chǎn)生值與產(chǎn)氫菌密切相關(guān)，隨后階段發(fā)生的CH4與H2漲消現(xiàn)象預(yù)示嗜酸產(chǎn)甲烷菌與嗜氫產(chǎn)甲烷菌在相關(guān)階段扮演角色(即產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢種)的變化，但可能存在兩種產(chǎn)甲烷菌群的共生或更替關(guān)系；最后階段存在痕量的H2，意味二者共生的可能性更高。由此進(jìn)一步推測園區(qū)餐廚垃圾單獨(dú)高溫發(fā)酵過程的微生物群落演替，除相關(guān)微生物群落中優(yōu)勢種的形成、更替與基因繼承外，還包括互惠或單向利用等共生關(guān)系。

2.3 厭氧污泥協(xié)同餐廚垃圾高溫發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液COD降解及產(chǎn)氣的影響

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了厭氧污泥的添加量對(duì)餐廚垃圾協(xié)同高溫發(fā)酵體系COD降解及其產(chǎn)氣積累過程的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2(a)可以發(fā)現(xiàn)，隨著厭氧污泥的添加及其量的增加，發(fā)酵液COD最高值均比餐廚垃圾單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的最大值(70 000 mg/L)低，且添加量越多，COD最高值越??；此外，從前6天的變化趨勢上看，添加量為1∶4時(shí)，趨于餐廚垃圾單獨(dú)發(fā)酵規(guī)律；為2∶3時(shí)，趨于厭氧污泥單獨(dú)發(fā)酵規(guī)律；當(dāng)達(dá)到3∶2及4∶1時(shí)，厭氧污泥占比相對(duì)較高，由餐廚垃圾中的有機(jī)物水解所提供的有機(jī)碳僅能夠滿足或不能夠滿足此時(shí)系統(tǒng)微生物群落的攝食需求。因?yàn)槲⑸锏谋仍鲩L速率和限制性基質(zhì)濃度具有Monod生長動(dòng)力學(xué)規(guī)律，當(dāng)基質(zhì)充分時(shí)，細(xì)菌的增長速率與基質(zhì)濃度無關(guān)；基質(zhì)不充分時(shí)，細(xì)菌的增長速率則遵循一級(jí)基質(zhì)代謝規(guī)律，此時(shí)有機(jī)物濃度的多少成為微生物群落生長速率的限制性因素。因此，在給定的OLR，穩(wěn)定期發(fā)酵體系的微生物生長期為減速生長期，微生物群落的數(shù)量趨于最高值；否則，在外界提供的OLR不能夠滿足群落需求時(shí)，則發(fā)展成為內(nèi)源呼吸期，微生物總量則趨于下降，如厭氧污泥占比為4∶1的協(xié)同發(fā)酵系統(tǒng)。

不同比例下的產(chǎn)氣積累量也進(jìn)一步支持了上述的觀點(diǎn)，如圖2(b)所示。從圖中可以看出，隨著厭氧污泥的添加及其量的增加，協(xié)同發(fā)酵體系的產(chǎn)氣積累量最大值介于厭氧污泥與餐廚垃圾單獨(dú)高溫發(fā)酵產(chǎn)氣積累量之間；其中厭氧污泥添加比例為1∶4時(shí)及2∶3時(shí)，產(chǎn)氣總量分別為17 540 mL及17 440 mL，為協(xié)同發(fā)酵體系的相對(duì)最高值。因此，結(jié)合運(yùn)行處理能力及處理效率，將協(xié)同發(fā)酵體系的厭氧污泥添加比例控制在1∶4～2∶3最為合適；不僅能夠獲得最佳的產(chǎn)氣效率，而且在此比例下微生物群落處于對(duì)數(shù)生長期，對(duì)餐廚垃圾中的有機(jī)物代謝速率也達(dá)到最高，這一點(diǎn)可以從圖2(c)中發(fā)酵體系COD的降解率上得到充分的說明。

圖2 厭氧污泥協(xié)同餐廚垃圾高溫發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液COD降解及產(chǎn)氣的影響

此外，當(dāng)協(xié)同發(fā)酵體系的厭氧污泥添加比例控制在0至2∶3時(shí)，均會(huì)出現(xiàn)4個(gè)較為明顯的產(chǎn)氣峰值平臺(tái)期；并且隨著厭氧污泥添加量增加，產(chǎn)甲烷穩(wěn)定期到來的時(shí)間逐漸縮短。這些結(jié)果也進(jìn)一步表明采用高溫協(xié)同厭氧發(fā)酵處理園區(qū)餐廚垃圾時(shí)，厭氧污泥作為種菌污泥參與餐廚垃圾高溫發(fā)酵處理具有可行性，不僅具有較好的處理效果，而且還具有較高的環(huán)境與經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，一旦因各種因素導(dǎo)致協(xié)同發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行失控，處理效率及產(chǎn)氣量的大幅度下降，則可按照厭氧污泥比例從4∶1、逐步過渡到3∶2的添加量，可使失衡的發(fā)酵系統(tǒng)在20 d內(nèi)迅速恢復(fù)到穩(wěn)定的產(chǎn)甲烷平衡階段，與餐廚垃圾單獨(dú)高溫發(fā)酵的恢復(fù)期相比，可縮短30 d以上。

2.4 厭氧污泥協(xié)同餐廚垃圾高溫發(fā)酵穩(wěn)定期的微生物多樣性分析

厭氧污泥及協(xié)同發(fā)酵穩(wěn)定期生物樣品經(jīng)高通量測序的結(jié)果如表2所示。2份樣品測序分別獲得17 631 000及15 500 000 Bases(bp)，過濾后的有效序列平均長度分別為456.48 bp及452.27 bp,Reads分別為70 524 及62 000。2樣品測得的OUT數(shù)分別為1 640個(gè)及1 109個(gè)，前者OTU平均數(shù)目比后者OUT數(shù)多531個(gè)。厭氧污泥樣品的Coverage值為99.6%，協(xié)同發(fā)酵穩(wěn)定期生物樣品的達(dá)到100%，說明測序結(jié)果如實(shí)表達(dá)了樣品所代表的微生物群落的客觀現(xiàn)狀。

表2 厭氧污泥及協(xié)同穩(wěn)定發(fā)酵期生物多樣性分析

其中，厭氧污泥的Shannon值及Simpson值分別為8.614及0.992, Chao1值為1 649.563；分別高于協(xié)同發(fā)酵穩(wěn)定期生物樣品的相關(guān)值(6.702、0.962及1 109.143)。通常，生物多樣性指數(shù)Shannon值越大說明群落的多樣性越高，Chao1值越大說明群落的豐富度越高；因此，厭氧污泥樣品的微生物多樣性和豐富度相對(duì)更高，這意味著發(fā)酵的高溫淘汰了厭氧污泥微生物群落中的不適種，選擇了協(xié)同發(fā)酵體系中的耐高溫種群。

2份生物樣本在不同分類水平下的物種種類數(shù)目如表3所示。從表中可以看出，協(xié)同發(fā)酵穩(wěn)定期污泥生物樣本在門、綱、目及科水平上的物種數(shù)量分別僅為菌種樣本的物種數(shù)的69.7%、52.2%、34.6%及39.6%。這進(jìn)一步說明反應(yīng)器的發(fā)酵環(huán)境條件，尤其是高溫的脅迫效應(yīng)，驅(qū)動(dòng)了協(xié)同發(fā)酵種群污泥中的微生物群落的分化、選擇與適應(yīng)[6]。

表3 2份生物樣本在不同分類水平下的物種種類數(shù)目對(duì)比

同時(shí)，用R語言統(tǒng)計(jì)了2份生物樣本的種水平(Species)微生物種類數(shù)，結(jié)果表明厭氧污泥及協(xié)同穩(wěn)定發(fā)酵期污泥樣品中的微生物種類分別為1 558種及1 027種，其中的共有種類僅為82種，分別占其各自物種數(shù)量的5.3%及8.0%。這一結(jié)果充分的說明了經(jīng)過前3個(gè)產(chǎn)氣累積峰值平臺(tái)期的高溫、高OLR、低pH、有毒代謝副產(chǎn)物環(huán)境因子的選擇壓力，在第4個(gè)產(chǎn)氣累積峰值平臺(tái)期到來時(shí)僅繼承保留了厭氧污泥中的5.3%的微生物種類，新建微生物種類為945種，占比高達(dá)94.7%[7]。

對(duì)上述2份生物樣本中上千種微生物物種，按照Top 30的物種，用R語言統(tǒng)計(jì)并作不同物種的相對(duì)豐度圖(圖3)。其中，擬桿菌門(Bacteroidetes)是2份生物樣品中均具有的最豐富的微生物，分別大約占28%及31%，是微生物群落的關(guān)鍵建群物種；同時(shí)此類微生物在餐廚垃圾協(xié)同高溫發(fā)酵過程中得到延續(xù)與發(fā)展。但厭氧污泥中的變形菌門(Proteobacteria)及酸桿菌門(Acidobacteria)的大多數(shù)微生物在其協(xié)同高溫發(fā)酵過程中遭到淘汰，隨后被厚壁菌門(Firmicutes)及熱袍菌門(Thermotogae)的微生物所替代。因?yàn)镕irmicutes門及Thermotogae門具備適生的生物結(jié)構(gòu)及生理特性資本，并能在高溫、高OLR等脅迫因子的環(huán)境條件下對(duì)餐廚垃圾降解起主要生化作用，參與對(duì)多種復(fù)雜有機(jī)質(zhì)(如：淀粉、蛋白質(zhì)及油脂等)的降解，為人類餐廚垃圾資源化及無害化處置作貢獻(xiàn)[8]。

圖3 2份生物樣品在門水平上的主要微生物種群及其相對(duì)豐度

3 結(jié)語

本文系統(tǒng)的開展了厭氧污泥協(xié)同餐廚垃圾高溫厭氧發(fā)酵的資源化實(shí)驗(yàn)研究。通過對(duì)反應(yīng)器產(chǎn)量采集、發(fā)酵液理化指標(biāo)及生物樣品的高通量測序分析，以厭氧污泥及餐廚垃圾單獨(dú)高溫發(fā)酵為對(duì)照，探討了厭氧污泥協(xié)同餐廚垃圾高溫厭氧長達(dá)66天發(fā)酵過程的產(chǎn)氣累積量與氣相組分、COD降解隨時(shí)間的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在停留時(shí)間、有機(jī)負(fù)荷率完全一致的情況下，餐廚垃圾的占比與甲烷產(chǎn)生效率、產(chǎn)量之間為正相關(guān)的關(guān)系；餐廚垃圾在混合基質(zhì)中所占的比例對(duì)于有機(jī)降解率具有決定性作用，占比越大，有機(jī)降解率就越高。另外對(duì)接種污泥及發(fā)酵后的混合污泥進(jìn)行了高通量測序檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了餐廚垃圾協(xié)同高溫發(fā)酵系統(tǒng)的微生物群落的主要建群微生物擬桿菌門(Bacteroidetes)及種群演替規(guī)律。研究結(jié)果可為屬地餐廚垃圾資源化利用及無害化處理工藝設(shè)計(jì)、處理系統(tǒng)穩(wěn)定、高效運(yùn)行及風(fēng)險(xiǎn)管理與應(yīng)急處置提供科學(xué)依據(jù)。