頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定拉帕替尼原料藥7 種有機(jī)溶劑殘留量*

付丙月，王金虎，王穎超，段崇剛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院·山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250011）

拉帕替尼（商品名泰立沙）是一種口服的小分子表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKI），由英國葛蘭素史克公司研發(fā)，于2007 年3 月由美國食品藥物管理局批準(zhǔn)上市，聯(lián)合卡培他濱治療表皮生長因子受體2（HER2）過度表達(dá)的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。目前，拉帕替尼在國內(nèi)是曲妥珠單抗耐藥患者的一線治療用藥［1－4］，其多條合成路線及工藝優(yōu)化中，均使用了乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑［5－12］。為保障藥品質(zhì)量和用藥安全，減輕溶劑殘留對(duì)人體及環(huán)境的危害，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）、各國藥典等均對(duì)藥品中有機(jī)溶劑殘留量限度作出了規(guī)定。本研究中參照2020 年版《中國藥典（四部）》的相關(guān)規(guī)定，參考文獻(xiàn)［13］的研究方法，采用氣相色譜（GC）法測(cè)定拉帕替尼原料藥中7 種有機(jī)溶劑的殘留量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890A 型氣相色譜儀，配有7694E 型頂空自動(dòng)進(jìn)樣器（美國安捷倫公司）；XS－205 型電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

拉帕替尼原料藥（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)分別為20190802，20190807，20190812，20190819，20170627，20190820，20190829，純 度 分 別 為 99.9% ，99.8% ，99.9% ，99.8% ，99.9% ，99.9%，99.9%）；二甲亞砜（色譜純，默克股份兩合公司）；N，N－二甲基甲酰胺（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙醇、丙酮、異丙醇、甲苯、二氯甲烷、四氫呋喃（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent DB －624 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.8μm）；色譜柱起始溫度：30 ℃，保持 6 min，以 30℃ ／min的速率升至200 ℃，保持6 min；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度：200 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；載氣：氮?dú)?；流速?.0 mL ／min；分流比：10 ∶1；頂空進(jìn)樣瓶容積：10 mL；平衡溫度：80 ℃；平衡時(shí)間：35 min；進(jìn)樣量：5 mL。精密量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各5 mL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，理論板數(shù)按乙醇峰計(jì)不低于3 000。該色譜條件下R 值均＞3，混合對(duì)照品溶液各待測(cè)組分峰基線完全分離，空白溶劑二甲亞砜對(duì)其他成分的色譜峰無干擾。詳見圖1。

圖1 氣相色譜圖1. Ethanol 2.Acetone 3.Isopropanol 4.Dichloromethane 5. Tetrahydrofuran 6.Toluene 7. N，N － dimethylformamide 8.Dimethyl sulfoxideA. Blank solvent B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 Gas chromatograms

2.2 溶液制備

分別取乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液1 mL，置100 mL 容量瓶中，制成每 1 mL 分別含乙醇 500 μg、丙酮 500 μg、異丙醇 500μg、二氯甲烷 60μg、四氫呋喃 70μg、甲苯 90μg、N，N－二甲基甲酰胺90 μg 的混合對(duì)照品溶液。取拉帕替尼原料藥0.5 g，精密稱定，置10 mL 頂空瓶中，精密加入二甲亞砜5 mL，密封，輕搖使溶解，即得供試品溶液。精密量取二甲亞砜5 mL，置10 mL 頂空瓶中，密封，即得空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加入二甲亞砜定容，搖勻，即得系列線性混合對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各5 mL，置10 mL 頂空瓶中，加蓋密封，于頂空進(jìn)樣器中平衡30 min，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積（ Y）為縱坐標(biāo)、各組分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）確定：取混合對(duì)照品溶液，加二甲亞砜逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，按信噪比（S／ N） ＝10計(jì)算 LOQ，按 S ／ N ＝ 3 計(jì)算 LOD。結(jié)果見表 1。

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，共6 份，置 10 mL 頂空瓶中，密封，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果表明儀器精密度良好，詳見表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20190820）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，置10 mL 容量瓶中，加入混合對(duì)照品溶液0.5 mL，加二甲亞砜定容，搖勻。精密量取供試品溶液5 mL，共6 份，置10 mL 頂空瓶中，密封，分別于室溫下放置 0，2，4，6，10，16 h 時(shí)，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置16 h 內(nèi)穩(wěn)定，詳見表1。

表1 各待測(cè)成分線性回歸方程、線性范圍、LOQ 和LOD 測(cè)定及精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Linear regression equation，linear range，LOQ and LOD，precision，stability and repeatability tests of each component（n ＝6）

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20190820）適量，共6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算溶劑殘留量。結(jié)果均未檢出乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺峰面積，乙醇?xì)埩袅康钠骄禐?.01%，RSD 為 7.90%（n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知有機(jī)溶劑含量的樣品（批號(hào)為20190820）9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液適量，各3 份，超聲，溶解，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9，%）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝9，%）

2.4 樣品有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定

取 7 批樣品 （批號(hào)分別為 20190802，20190807，20190812，20190819，20170627，20190820，20190829）各0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定結(jié)果（n ＝3，%）Tab.3 Content determination of the residual organic solvents in the sample（n ＝3，%）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

GC 法通常采用水、醇、N，N－二甲基甲酰胺、二甲亞砜等作為溶劑，本研究中 N，N－二甲基甲酰胺是殘留溶劑之一，無法作為溶劑使用；甲苯極性較小、不溶于水；拉帕替尼雖為磺酸鹽形式，但溶于二甲亞砜，難溶于水和乙醇，甲醇中溶解度同樣較低。同時(shí)，二甲亞砜保留時(shí)間在拉帕替尼各殘留溶劑的保留時(shí)間之后，與各組分峰完全分離，對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾。因此，選用二甲亞砜為提取溶劑。

3.2 進(jìn)樣方式選擇

頂空進(jìn)樣通常在低溫下進(jìn)行，不僅可減少樣品及溶劑對(duì)色譜系統(tǒng)的干擾和污染，還可延長色譜柱的使用壽命，優(yōu)勢(shì)明顯。本試驗(yàn)中各待測(cè)殘留溶劑的沸點(diǎn)相差較大，特別是二氯甲烷的沸點(diǎn)為39.8 ℃，極易揮發(fā)，受溫度影響明顯，非常適合選用頂空進(jìn)樣方式。雖然 N，N－二甲基甲酰胺的沸點(diǎn)較高，更適合直接進(jìn)樣，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，頂空進(jìn)樣不影響其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，故最終選用頂空進(jìn)樣方式。

3.3 色譜柱選擇

由于拉帕替尼各殘留溶劑極性差異較大，甲苯極性非常弱，不溶于水，通常被近似認(rèn)為非極性分子；而 N，N－二甲基甲酰胺屬強(qiáng)極性溶劑，極性僅次于水。因此，考察了INNOWAX 型、HP － 5 型、AT －5 型、DB －WAXETR 型、DB－624 型等多種不同極性的氣相色譜柱，結(jié)果采用DB－624 型色譜柱時(shí)，各待測(cè)成分色譜峰分離良好，峰形尖銳對(duì)稱，無拖尾、漏檢，與其他峰無干擾，故選擇DB－624 型毛細(xì)管色譜柱。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的同時(shí)測(cè)定拉帕替尼原料藥中乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺7 種有機(jī)溶劑殘留量的頂空GC 法，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于拉帕替尼原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的控制。