基于網絡藥理學的甲潑尼龍治療腹膜纖維化作用機制研究*

蔡家駒，戴衛(wèi)波，吳惠妃，葉秋明，蕭俊祺

（廣東省中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

腹膜纖維化（PF）為長期腹膜透析（PD）患者的主要和嚴重并發(fā)癥，是導致PD 失敗的主要原因［1］，目前仍缺乏有效的防治措施。甲潑尼龍（MP）屬糖皮質激素，具有抑制結締組織中成纖維細胞增生及膠原合成的作用，可用于治療以增生為主的慢性炎癥，如肺間質纖維化［2］。網絡藥理學可借助分子生物學和相關數據庫信息，從組織水平預測藥物對疾病治療作用的機制［3］。本研究中采用網絡藥理學的方法，通過構建并分析化學成分－疾?。饔冒悬c網絡，從整體上揭示MP 治療PF 多靶點、多途徑的作用機制，為進一步探討MP 治療PF 的療效提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 運用數據庫和工具

數 據 庫 ：PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／），Swiss Target Prediction （http：／ ／www. swisstargetprediction.ch ／），GeneCards（https：／ ／www.GeneCards.org ／）， OMIM（https：／ ／omim.org ／）， STRING v11.0（http：／ ／String － db.org ／）。工具：Bioconductor（http：／ ／www.Bioconductor.org ／），R v3.6.3 軟 件 （https：／ ／www.r－ project.org ／），Cytoscape v3.7.2 軟件（http：／ ／Cytoscape.org ／）。

1.2 化學成分作用靶點預測

通過PubChem 數據庫檢索MP 的化學結構，并以sdf 格式保存其 2D 結構，然后將 sdf 文件導入Swiss Target Prediction 數據庫中，限定研究物種為人類（Homospiens），查詢MP 的潛在作用靶點信息。

1.3 疾病靶點預測

以“Peritoneal Fibrosis”作為關鍵詞，在 GeneCards數據庫和OMIM 數據庫中分別檢索，查找與PF 相關的基因，合并相關數據庫，刪除重復和假陽性基因，獲得PF 的作用靶點信息數據集。

1.4 化學成分－疾?。饔冒悬c預測

采用編程軟件R v3.6.3 編寫命令代碼，分別導入1.2 與1.3 項下所得相關靶點信息文件，并繪制 Venn圖，獲得MP 靶點基因和PF 靶點基因交集文件，用于網絡構建與分析。

1.5 化學成分－疾病－作用靶點網絡構建和分析

根據 1.4 項下的作用靶點預測結果，使用Cytoscape 3.7.2 軟件構建化學成分－疾?。饔冒悬c網絡，節(jié)點代表藥物、疾病及作用靶點；邊分別用作連接藥物與作用靶點、疾病與作用靶點，體現化學成分－疾?。饔冒悬c間的聯系。

1.6 蛋白質－蛋白質相互作用（PPI）網絡構建和分析

利用 STRING v11.0 數據庫導入 MP 和 PF 的共同靶點基因文件，限定研究物種為人類（Homosapiens），搜索獲得PPI 網絡，并以tsv 格式文件導出。將該文件中node1，node2，Combined score 信息分別導入 Cytoscape v3.7.2 軟件，構建 PPI 網絡，然后利用該軟件的插件Network Analyzer 分析網絡拓撲參數，獲取節(jié)點度（degree）、介數中心性（BC）、緊密中心性（CC）等網絡信息。

1.7 靶點生物功能注釋分析

Bioconductor 是一個通過應用編程軟件R 對高通量基因組數據進行分析和解釋的工具。首先加載Bioconducter 的Clusterprofiler 包，然后導入作用靶點的基因數據并運行代碼，對化學成分－疾?。饔冒悬c網絡中的基因進行基因本體（GO）功能注釋，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設定P ＜0.01 為有顯著性，將結果分別以柱狀圖和氣泡圖形式呈現，并根據富集因子值分析核心通路的富集程度，展示MP 治療PF 的作用通路。

2 結果

2.1 化學成分靶點預測結果

利用Swiss Target Prediction 數據庫合并重復數據后，共收集到MP 的潛在靶點100 個。其中，核受體占26.7%，分泌蛋白占 20.0%，酶占 13.3%。詳見圖 1。MP占比居前10 位的作用靶點基因見表1。

圖1 MP 潛在靶點分類Fig.1 Classification of potential targets of MP

表1 MP 占比前10 位作用靶點基因Tab.1 Top 10 MP target genes

2.2 PF 靶點預測結果

檢索GeneCards 和OMIM 數據庫，合并數據并剔除重復靶點后，共獲得2 104 個PF 疾病靶點基因。靶點類型主要為蛋白質（Protein Coding）和 RNA 基因（RNA Gene）。按相關性得分大小列出前10 位靶點基因，詳見表2。

表2 PF 相關性居前10 位的作用靶點基因Tab.2 Top 10 PF target genes

2.3 化學成分－疾?。饔冒悬c預測結果

將MP 及PF 各自的作用靶點信息導入編程軟件R，通過繪制Venn 圖，共獲得65 個共同靶點基因（見圖2）。分別為白細胞介素6（IL－6）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及TJP1，ALOX12，SOD2，CCNE1，MUC1，RAB7A，HBB，DICER1，NR3C1，AR，ADAM17，GLUL，GPBAR1，SHBG，PGR，CYP19A1，HSD11B2，NOS2，ADORA3，ESR2，PTGS1，CDC25A，PRKCA，MPO，TKT，CA12，CDK1，CREBBP，XIAP，RBP4，MAP3K5，JAK1，MAP2K1，SLC5A1，HLCS，ALPL，GRK2，CNR1，EIF2AK3，JAK2，PTPN11，ERBB2，ERBB4，PARP1，ADK，MAP3K8，SLC18A3，ALOX5，CDK2，KIT，FLT3，PIM1，KDR，MAP2K2，PIK3CA，ALK，ADORA1，OPRM1，TTR。

圖2 65 個共同靶點基因的Venn 圖Fig.2 Venn diagram of 65 common target genes

2.4 化學成分－疾?。饔冒悬c網絡分析

使用 Cytoscape v3.7.2 軟件導入 MP 與 PF 的共同靶點基因，建立化學成分－疾?。饔冒悬c網絡關系圖（見圖 3）。

圖3 化學成分－疾?。饔冒悬c網絡關系圖Fig.3 PPI network diagram of ingredient－disease－target

2.5 PPI 網絡分析

將 MP 與 PF 的共同靶點基因導入 STRING v11.0數據庫中，獲取一個包含65 個節(jié)點和383 條邊的PPI網絡（見圖 4）。采用 Cytoscape v3.7.2 軟件分析其拓撲性質，一般認為節(jié)點度（degree）值不低于所有節(jié)點度2 倍中位數的節(jié)點，即對整個網絡具有重要貢獻意義。65 個共同靶點中，degree 值大于中位數（degree ＝ 12）2 倍的靶點共有 8 個（見表 3）。

表3 PPI 網絡分析結果（degree ＞ 24）Tab.3 Results of PPI network analysis（degree ＞ 24）

圖4 65 個共同靶點PPI 網絡分析圖Fig.4 PPI network diagram of 65 common target

2.6 GO 功能注釋及KEGG 通路富集分析結果

為進一步闡明MP 對PF 的作用機制，利用Bioconductor 輸入代碼，對化學成分－疾病－作用靶點網絡中的65 個靶點進行GO 功能注釋，結果共獲得53 個條目，其中具有顯著意義（P ＜ 0.01）的有 19 條。由圖 5 和圖 6 可見，MP 靶點主要富集在 protein serine／threonine kinase activity（GO：0004674），protein tyrosine kinase activity（GO：0004713），phosphatase binding（GO：0019902），transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（GO：0004714），transmembrane receptor protein kinase activity（GO：0019199），steroid binding（GO：0005496），heme binding（GO：0020037），protein phosphatase binding（GO：0019903），tetrapyrrole binding（GO：0046906），hormone receptor binding（GO：0051427）等生物過程中。此外，通過KEGG 分析富集到MP 與PF 治療靶點相關的基因通路共 10 條（圖 7 和圖 8），具有顯著意義（P ＜0.01）的有7 條，包括 MAPK signaling pathway（hsa04010），EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance（hsa01521），Rap1 signaling pathway（hsa04015）， Ras signaling pathway（hsa04014），ErbB signaling pathway（hsa04012），Endocrine resistance（hsa01522），Platinum drug resistance（hsa01524）等。

圖5 65 個共同靶點的GO 分析結果柱狀圖Fig.5 A bar chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖6 65 個共同靶點的GO 分析結果氣泡圖Fig.6 A bubble chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖7 65 個共同靶點的KEGG 通路富集分析結果柱狀圖Fig.7 A bar chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

圖8 65 個共同靶點的KEGG 通路富集分析結果氣泡圖Fig.8 A bubble chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

3 討論

本研究中通過網絡藥理學的方法，利用多個在線數據庫，收集到100 個不重復的MP 作用靶點，并預測到2 104 個不重復的PF 疾病靶點，通過繪制Venn 圖得到65 個共同靶點基因，并以此構建了化學成分－疾?。饔冒悬c網絡，獲得了1 個具有65 個節(jié)點和383 條邊的PPI 關系網絡；網絡分析結果顯示，在65 個作用靶點中，degree 值大于 24 的靶點有 8 個，包括 IL－6，MAPK3，MAPK1，EGFR，mTOR，MAPK14 等；此外，通過GO 功能注釋和KEGG 富集分析，對65 個共同靶點基因進行了分析，并根據 P ＜0.01 確定了 19 條 GO 分析信息及7 條作用通路，如蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、MAPK 信號通路和EGFR 信號通路等。

IL－6 是一種多效性細胞因子，能刺激細胞生長，促進細胞外基質增生，參與炎性反應。IL－6 可由成纖維細胞、間皮細胞和血管內皮細胞等多種細胞生成。在PD 過程中，腹腔會局部產生IL－6，且在產生腹膜炎時明顯升高［4－5］。經常性炎性反應可激活適應性免疫反應，使基質中的細胞因子信號轉導發(fā)生改變，從而導致纖維化和慢性炎癥［6］。上皮間質分化（EMT）是指上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在慢性炎癥和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用［7］。研究證實，IL－6通過激活JAK2／STAT3 信號通路，誘導人腹膜間皮細胞（HPMC）發(fā)生 EMT，最終引起 PF［8］。糖皮質激素具有明顯的抗炎作用，可抑制腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL －6，IL －8 等多種炎性細胞因子生成。因此，MP 可能通過調控IL－6 起到抑制PF 的作用。

mTOR 是位于磷脂酰肌醇3 激酶 ／絲氨酸激酶（PI3K／AKT）通路下游的一種重要的絲氨酸／蘇氨酸激酶，在細胞內作為功能性亞基參與mTORC1 和mTORC2 2 種復合體的形成。mTORC1 可被生長因子、氨基酸、氧、能量等激活，通過影響mRNA 翻譯，蛋白質、脂質和核苷酸的合成，細胞自噬等生物過程調控細胞的生長代謝［9］。mTORC2 的功能主要體現在細胞存活、遷移等方面［10］。研究顯示，PI3K －AKT － mTOR 信號通路的異常與多種纖維化性疾病有關，如肺纖維化［11］、腎臟纖維化［12］等。轉化生長因子 β1（TGF － β1）是公認的強致纖維化因子。近年來有學者發(fā)現，HPMC 在 TGF － β1的刺激下，mTOR 信號通路活化及纖維化改變，提示mTOR 信號通路也參與到 PF 的發(fā)生、發(fā)展過程中［13］。據此推測，調控mTOR 通路可能是MP 治療PF 的一個重要途徑。

根據KEGG 通路富集分析結果，MAPK 通路富集基因最多，如PPI 網絡分析中dgree 值較高的靶點MAPK3（ERK1），MAPK1（ERK2），MAPK14（p38α）均屬 MAPK家族成員。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路主要有細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）、Jun 氨基末端激酶（JNK）和 p38 3 條通路。ERK1 ／2 通路可調控細胞的生長和分化，JNK 和p38 通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用。研究顯示，ERK1／2 和p38 信號通路均參與了 PF 的發(fā)病過程［14－17］，兩者在 TGF － β1致HPMC 細胞外基質過度表達中起調控作用［15－17］。因此，MP 可能通過作用于 MAPK 通路中的 ERK1／2 和 p38信號通路，實現對PF 的調控。

EGFR 是一種具有酪氨酸激酶活性的受體，受表皮生長因子（EGF）和TNF－α 等配體的激活后，通過信號轉導將有絲分裂的信號從細胞表面?zhèn)鞯郊毎藘?，從而調節(jié)細胞的生長、增殖、分化等生理過程。研究發(fā)現，PD患者的 HPMC 表達 EGFR 及其配體 EGF［18］，EGFR 信號通路的激活參與了 HPMCs 的 EMT 過程［19］，給予 EGFR 阻斷劑后可減少 PF 程度［19－20］。由此推測，MP 可能也通過干擾EGFR 信號通路的激活機制而起到抑制PF 的作用。

綜上所述，采用網絡藥理學的方法，通過構建化學成分－疾?。饔冒悬c相互作用網絡，發(fā)現MP 可能具有抗 PF 的作用，其作用機制與 IL －6，mTOR，EGFR，MAPK 通路等相關。