黃蓋鰈活體種質(zhì)資源保存關(guān)鍵技術(shù)研究

文/李秀梅 張寧 李丁軍 齊魯 于文松 王田田

為建立優(yōu)良的黃蓋鰈活體種質(zhì)資源庫，本團隊開展了黃蓋鰈活體種質(zhì)資源保存方法、活體種質(zhì)庫管理技術(shù)路線及質(zhì)量控制措施等方面的研究，采用室外圍堰保種池和室內(nèi)養(yǎng)殖池接力的方式，低碳高效，創(chuàng)新了活體種質(zhì)資源保存方式，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

黃蓋鰈（Pseudopleuronectes yokohamae），屬鰈形目、鰈科、黃蓋鰈屬，其肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)價值高，是我國黃海、渤海海域鲆鰈類中重要經(jīng)濟品種之一，漁期多在每年的5月份和8月份。然而近些年由污染的生態(tài)環(huán)境、不合理的捕撈等因素引發(fā)黃蓋鰈種質(zhì)退化等一系列問題，使得黃蓋鰈優(yōu)良種質(zhì)資源的保護成為鲆鰈魚養(yǎng)殖業(yè)中亟需解決的問題。為了保護野生漁業(yè)資源，我國在山東省蓬萊市近海海域設(shè)立了蓬萊牙鲆黃蓋鰈國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)，保護區(qū)主要保護對象為鈍吻黃蓋鰈（俗稱“地生子”）等經(jīng)濟魚類。此外，2013年12月30日，原農(nóng)業(yè)部正式批準對“蓬萊地生子”實施國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護。近年來，黃蓋鰈養(yǎng)殖產(chǎn)量占鲆鰈類魚類增養(yǎng)殖產(chǎn)量的比重越來越大，其價值和效益不斷提高，在國內(nèi)水產(chǎn)品市場、國際貿(mào)易市場中占有重要地位。

《中共中央國務(wù)院關(guān)于全面推進鄉(xiāng)村振興加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化的意見》即2021年中央一號文件明確提出：農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，種子是基礎(chǔ)，要求打好種業(yè)翻身仗，更好地保護、挖掘、研究和利用種質(zhì)資源，提高種業(yè)發(fā)展基礎(chǔ)性公益性服務(wù)能力。水產(chǎn)種質(zhì)資源是遺傳改良、苗種培育和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。黃蓋鰈野生資源的高效利用、收集與保護等工作的開展，既是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要，也是推進生態(tài)文明建設(shè)和促進人與自然和諧發(fā)展的重大舉措。本試驗對黃蓋鰈活體種質(zhì)資源保存關(guān)鍵技術(shù)進行研究，以期為黃蓋鰈種質(zhì)資源庫的建立及種質(zhì)的長期保存、人工育種繁殖提供理論基礎(chǔ)。

一、試驗地點及設(shè)施

本研究試驗于2013年7月至今在國家級山東蓬萊黃蓋鰈原種場內(nèi)進行，該場位于蓬萊海域，附近無陸源污染。原種場基地擁有工廠化育苗與養(yǎng)殖車間3800m2，其中苗種車間4000m2（有效育苗水體面積3200m2），原種培育車間1000m2，親魚培育及良種選育車間2000m2；露天保種池2個，共30hm2。場區(qū)內(nèi)各類育苗養(yǎng)殖配套設(shè)施齊全，餌料培育車間2000m2，餌料加工冷庫（600t）一座，水、電、氣、暖系統(tǒng)完備。

二、材料與方法

（一）獲取野生種質(zhì)資源

黃蓋鰈野生群體全部來自蓬萊牙鲆黃蓋鰈國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)。采捕種魚時要采用質(zhì)地柔軟（尼龍線）、小網(wǎng)目（小于5cm）的定置網(wǎng)具捕撈，裝魚容器的內(nèi)壁要光滑，嚴防其體表受傷。選取身體肥滿、體色正常（鮮艷，無白化）、鱗片和鰭膜完整、健康無病，雌魚2齡以上，體重800g以上，雄魚2齡以上，體重400g以上的個體。運輸時要充氣，并盡量縮短運輸時間。種魚群體的雌雄比例可按3:1～4:1。對選好的種魚群體進行種質(zhì)檢測，保證其遺傳基因的純合度符合物種標準。

（二）建立野生種質(zhì)資源保存方法

種質(zhì)資源保存環(huán)境及質(zhì)量控制方法見圖1。

圖1 種質(zhì)管理技術(shù)路線圖

1.露天保種池保種

將篩選合格的野生種魚放置于露天保種池內(nèi)進行馴化和保存。保種池平均水深2m，底質(zhì)為沙底，投放種魚前徹底清塘翻底消毒，然后調(diào)入自然海水。保種馴化期間投喂鮮活小雜魚蝦，每日換水量10%～20%，溶解氧控制在6.5mg/L～8.5mg/L之間。

2.車間內(nèi)保種

經(jīng)過露天保種池培育的種魚采用定置網(wǎng)具收獲后放入水泥池，開展黃蓋鰈室內(nèi)人工繁育。種魚培育池尺寸為5m×5m×1.2m，池底排水孔處安裝一水流調(diào)節(jié)器及水流循環(huán)管道。管道雙層內(nèi)徑分別為20cm和14cm，高1 6 5 c m，水流流速調(diào)節(jié)在2 0 L/min～48L/min。培育期間，間斷性充氣，氣石分布于近底層。其它各項環(huán)境因子包括：水溫12℃～15℃，鹽度30～33，pH7.7～8.6；溶解氧6mg/L以上。種魚投放密度為2尾/m2～3尾/m2，♀:♂=3:1。

（三）日常管理

定時監(jiān)測各項環(huán)境因子，維持各項因子在最適范圍內(nèi)。保持水體循環(huán)流動，每天換水率90%以上，水體透明度以看清池底為宜，清除殘餌、污物，除去死魚。新鮮海水注入前檢查種魚成活率，觀察其性腺發(fā)育程度及攝食情況并做好記錄。每日投餌2次，保證餌料供應(yīng)充足。餌料投喂量約為魚體重2%～3%，餌料種類以鮮雜魚和人工配合飼料為主。

（四）種質(zhì)的保存隔離

1.專池培育

不同批次、不同來源的黃蓋鰈親本分池養(yǎng)殖，單獨操作，進排水系統(tǒng)相對獨立，防止混雜；黃蓋鰈原種池與生產(chǎn)用種池獨立分區(qū)，并同其他區(qū)嚴格隔離；黃蓋鰈保種池和親本養(yǎng)殖池所需的水源必須經(jīng)過多級砂濾，以避免非親本黃蓋鰈或其它鰈類的遺傳污染。限制無關(guān)人員和不潔工具的進入，工作人員要經(jīng)過消毒程序才能進入種魚車間；使用的工具應(yīng)全新，不能借用、混用其它車間工具；親魚通常只能輸出，不能隨便輸入。

2.加強培育管理

種魚的培育管理工作需嚴格把關(guān)。種魚所用人工配合飼料應(yīng)符合NY5052-2001規(guī)定，使用藥物應(yīng)符合NY5071-2002規(guī)定，防止因飼料或藥物使用不當(dāng)而造成優(yōu)質(zhì)原種基因變異。對每批次野生魚的采捕時間、地點、規(guī)格、成活率等信息建立檔案；養(yǎng)殖過程中的投餌、用藥記錄以及水質(zhì)分析記錄等資料同時存放于檔案之中。

3.日常管理

維持各環(huán)境因子在適宜范圍內(nèi)，避免因環(huán)境不適而造成黃蓋鰈出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)；每日檢測環(huán)境常規(guī)指標，保持環(huán)境優(yōu)良而穩(wěn)定；檢查餌料投喂的各環(huán)節(jié)；保證車間環(huán)境衛(wèi)生等。吸污清底采用自主研發(fā)的養(yǎng)殖池手持吸底器，在長方形下底板的前后端分別設(shè)置驅(qū)魚支架，提前驅(qū)趕周圍的種魚，減輕對種魚的傷害。提前預(yù)防控制疾病的誘發(fā)因子，堅持防大于治的原則，保證種魚健康生長。

4.種質(zhì)監(jiān)測

監(jiān)測和評價指標包括：生物學(xué)性狀、個體大小、形態(tài)學(xué)特征、繁殖習(xí)性和生長；生態(tài)學(xué)特征包括對環(huán)境的適應(yīng)性和抗逆性；遺傳學(xué)特征包括細胞（染色體）、蛋白質(zhì)（酶）和DNA水平遺傳特征。

5.病害預(yù)防

合理利用已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥中的抗菌藥、消毒藥防病，同時增強種魚免疫力。禁止使用禁用抗生素及違禁藥物，可以采用已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥中的中藥材、中成藥。提倡使用國標水產(chǎn)用獸藥殺菌消毒。對培育過程中出現(xiàn)的死亡個體進行解剖，及時分析致病因素和制定有效防治措施，并做好《病害檢測記錄》。

（五）管理制度建設(shè)

為了保證種質(zhì)質(zhì)量，黃蓋鰈活體種質(zhì)庫研發(fā)技術(shù)中心特制定了一系列質(zhì)量保障體系和質(zhì)量控制措施，對整個過程嚴格監(jiān)管。

1.質(zhì)量保障體系

黃蓋鰈活體種質(zhì)庫建立了三個質(zhì)量保障體系：即標準化生產(chǎn)體系、疫情防控體系和產(chǎn)品質(zhì)量控制體系。標準化生產(chǎn)體系首先確定了應(yīng)用于生產(chǎn)的國家、行業(yè)標準，同時制定了黃蓋鰈養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范的企業(yè)標準，從而實現(xiàn)了黃蓋鰈活體種質(zhì)庫整個生產(chǎn)過程的標準化管理。疫情防治體系包括設(shè)立魚病檢測室和防疫專員，從而能快速、及時發(fā)現(xiàn)疫情，在疫病發(fā)生初期立即采取相應(yīng)措施。產(chǎn)品質(zhì)量控制體系體現(xiàn)在黃蓋鰈活體種質(zhì)庫配備專職的質(zhì)量管理員，并把質(zhì)量控制延伸到生產(chǎn)的每個階段。

2.質(zhì)量控制措施

（1）藥物控制措施

原種保存及培育中，做好養(yǎng)殖過程中藥物使用的登記備案制度，對藥物的采購、儲存、領(lǐng)取和使用的種類、數(shù)量、時間等實行全面監(jiān)督，每一步都要記錄、簽字并存檔，確保用藥的合理性和安全性。在生產(chǎn)中，嚴格按照NY507-2002規(guī)定的準則進行用藥，絕不使用國家禁止使用的違禁藥品和添加劑。

（2）飼料控制措施

在親魚培育、苗種生產(chǎn)和成魚養(yǎng)殖中所使用的飼料，嚴格按照NY5072-2002標準進行采購和喂用，拒絕使用腐敗變質(zhì)、生蟲以及污染的飼料。餌料魚應(yīng)新鮮、無變質(zhì)、無病害。在飼料中使用的添加劑必須在配方中明確記入，在使用時，還要詳細記錄生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)日期、采購時間、使用數(shù)量等，并由操作人員簽字備案。

（3）水質(zhì)控制措施

水質(zhì)的控制從源頭抓起，對水的源頭地必須堅持長期監(jiān)控，平時檢測常規(guī)指標，每個月進行全面檢測。經(jīng)過沉淀、砂濾等凈化處理的海水，在進入培育車間前需每天定時檢測水質(zhì)指標，并記錄數(shù)據(jù)存檔，確保養(yǎng)殖用水符合NY5052-2001標準。

（4）嚴格出場檢驗制度

首先制定產(chǎn)品出廠程序和方法，對檢驗判定不符合標準的產(chǎn)品絕不出廠。正常生產(chǎn)時，每年至少進行一次周期性的型式檢驗。當(dāng)養(yǎng)殖條件發(fā)生變化可能影響產(chǎn)品質(zhì)量時（如養(yǎng)殖環(huán)境的大幅度變化、養(yǎng)殖中發(fā)生嚴重病疫情或?qū)夹g(shù)路線進行大幅調(diào)整等，或者國家質(zhì)量監(jiān)督機構(gòu)提出要求時），對NY5152-2002中規(guī)定的全部項目進行型式檢驗。

產(chǎn)品出售前以同一池作為一批次，休藥期結(jié)束后，停食24h～36h，按標準要求進行出廠檢驗和安全指標檢驗，出廠銷售時在包裝上標貼產(chǎn)品標簽。黃蓋鰈出廠檢驗項目為感官檢驗，由本公司質(zhì)檢員在車間執(zhí)行，并將檢測結(jié)果記錄入檔。

（六）質(zhì)量跟蹤及種質(zhì)檢測

種質(zhì)鑒定圖譜見圖2、圖3、圖4。對保存的原種定期進行生態(tài)環(huán)境、形態(tài)、生長、生理和遺傳性狀的種質(zhì)測定。對售出的苗種進行跟蹤調(diào)查，掌握其生長和質(zhì)量狀況。通過近5年的養(yǎng)殖效果看，黃蓋鰈性狀穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)種質(zhì)退化現(xiàn)象。

圖2 鈍吻黃蓋鰈染色體圖（2n=48）

圖3 鈍吻黃蓋鰈染色體核型圖（2n=48t）

圖4 鈍吻黃蓋鰈異檸檬酸脫氫酶電泳圖譜

三、工作成效

本研究建立了黃蓋鰈活體種質(zhì)資源庫。近兩年黃蓋鰈活體種質(zhì)庫共引進保存原始性狀的野生黃蓋鰈雌性親魚1520尾，雄性親魚510尾，并從后備親本中選擇個體較大，性狀優(yōu)良的個體雌性1800尾，雄性個體600尾，共計4430尾。2020年經(jīng)馴化培育、種質(zhì)檢測、篩選后，獲得1434尾合格雌性親本、515尾合格雄性親本，開展親本培育共獲得優(yōu)質(zhì)親本1733尾（雌性親本1300尾、雄性親本433尾），淘汰老化親本1668尾（雌性親本1270尾、雄性親本398尾）。黃蓋鰈活體種質(zhì)資源庫現(xiàn)有黃蓋鰈親本保存量6930尾（雌性親本5200尾、雄性親本1730尾），后備親本量5000尾（雌性親本3750尾、雄性親本1250尾）。本研究采用室外圍堰保種池和室內(nèi)養(yǎng)殖池接力的方式，低碳高效，創(chuàng)新了活體種質(zhì)資源保存方式，節(jié)約了生產(chǎn)成本。室外圍堰保種池馴化暫養(yǎng)是黃蓋鰈從自然海區(qū)過渡到養(yǎng)殖車間的必要階段。圍堰保種池與大海僅一墻之隔，定期注入自然海水，水質(zhì)良好，池底鋪設(shè)沙層，水環(huán)境條件更接近自然海區(qū)環(huán)境。黃蓋鰈活體種質(zhì)資源庫的建立，有助于提高山東省蓬萊黃蓋鰈品種資源保存和創(chuàng)新利用水平，對培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種，調(diào)整優(yōu)化水產(chǎn)品種結(jié)構(gòu)，加快煙臺市資源優(yōu)勢向科技和經(jīng)濟優(yōu)勢轉(zhuǎn)變有重要意義。

四、展望

近兩年野生黃蓋鰈原種采集難度不斷加大，主要表現(xiàn)為采集個體偏小且野生黃蓋鰈資源量明顯減少，推測是黃蓋鰈自然生長速度緩慢再加上過度捕撈等人為因素所致。因此，下一步活體種質(zhì)資源保存工作重點將會向人工選育優(yōu)良親本轉(zhuǎn)移，選擇生長速度快、抗逆性強、原始性狀明顯的優(yōu)良后代進行親本培育，并通過不斷加大黃蓋鰈增殖放流數(shù)量來提高海洋資源量。也希望漁業(yè)主管部門加強監(jiān)管，對違規(guī)采捕加大處罰力度，切實保護好黃蓋鰈野生資源量。此外，就目前完成的黃蓋鰈活體種質(zhì)資源保護工作來講，還需長期堅持分子層面的種質(zhì)資源研究。及時開展水產(chǎn)種質(zhì)資源保存研究，改善收集保存技術(shù)手段、建設(shè)信息化共享體系、完善共享機制，才能使山東省的黃蓋鰈種質(zhì)資源得到有效地整合和利用，助力我國黃渤海區(qū)域漁業(yè)經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展。